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桉树4个种遗传多样性的ISSR分析及STS标记开发初探

作　者: 田华
导　师: 张党权
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 森林培育
关键词: 桉树遗传多样性分子标记 ISSR STS 分子鉴定
分类号: S792.39
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 43次
引　用: 1次
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内容摘要

桉树是世界上第二大类人工造林树种,亦是目前最重要的木浆原料林之一。桉树种类繁多,有522种和150个变种,桉树树种之间容易杂交培育出超过亲本的杂交种,并容易培育成优良无性系进行无性繁殖,但其种源关系和品种鉴定较为困难。ISSR现已在林木的种质资源鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化、系统发育、分子标记育种等研究方面被广泛应用。ISSR标记以其多态性高、稳定性强、技术简便、方便快捷等优势必将使其在更多林木物种、更多林业领域获得应用。本论文以桉树的赤桉、巨桉、细叶桉和粗皮桉4个种18个样品为研究材料,分析了影响桉树ISSR-PCR的主要参数,包括模板DNA、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、退火温度等6个因素的影响,建立了适用的ISSR-PCR的分析体系：20μL的PCR反应体系中,1 x Taq酶缓冲液,0.5 U Taq DNA聚合酶,0.6μmol/L引物,100μmol/L dNTPs,2.5mmol/LMgCl2,20ng模板DNA；最佳PCR扩增条件为：预变性：94℃3min；94℃变性30sec,60℃退火45sec,72℃延伸1min 5个循环；58℃退火45sec,72℃延伸1min 5个循环；56℃退火45sec,72℃延伸1 min 5个循环；54℃退火45sec,72℃延伸1min 10个循环；52°退火45sec,72℃延伸1min 20个循环；共40个循环后,最后72℃延伸10min,4℃保存。根据优化的ISSR-PCR反应体系和扩增条件,从100条引物中筛选出12条扩增条带特异、条带数适中、背景清晰、重复性好的引物,总计扩增出120条清晰可重复的DNA条带,其中93条是多态性条带。每个引物可扩增的多态条带长度范围为300～2500 bp,数目在4～11条,平均为7.75条,多态带百分率为77.5%。然后通过软件POPGENE1.31、MVSP 32软件和NTSYS-pc软件对所得数据进行总结分析,从而得出4个种18个样品的遗传相似系数,并绘制分子聚类图和主坐标分析图,结果表明,4个种间遗传相似性差异较大,种内遗传相似性极高。此外,还对ISSR特异扩增序列进行回收测序,根据测序结果设计出19对桉树的STS标记的正反引物,筛选出6对引物可以扩增出目的条带,从而为开发出桉树的适宜STS分子标记打下了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词  7-11
1 绪论  11-29
  1.1 桉树概况  11
  1.2 桉树人工林发展现状  11-14
  1.3 分子标记概述  14-21
    1.3.1 RFLP  15
    1.3.2 RAPD  15-16
    1.3.3 SCAR  16-17
    1.3.4 AFLP  17
    1.3.5 SSR  17-18
    1.3.6 ISSR  18-19
    1.3.7 SNP  19
    1.3.8 SRAP  19-20
    1.3.9 TRAP  20
    1.3.10 STS  20-21
  1.4 分子标记技术在林业中的应用  21-25
    1.4.1 绘制品种(品系)的DNA指纹图谱  21
    1.4.2 种质资源的鉴定  21-22
    1.4.3 种质资源的遗传多样性研究  22-23
    1.4.4 品种亲缘关系分析  23
    1.4.5 遗传图谱的构建  23-24
    1.4.6 林木分子标记辅助选择育种  24-25
  1.5 分子标记技术在桉树研究中应用  25-26
  1.6 本研究的目的意义及技术路线  26-29
    1.6.1 目的及意义  26-28
    1.6.2 技术路线  28-29
2 桉树遗传多样性的ISSR分析  29-53
  2.1 实验材料与试剂  29-31
    2.1.1 植物材料  29
    2.1.2 实验试剂与药品  29
    2.1.3 主要仪器及设备  29
    2.1.4 引物序列及合成  29-31
  2.2 实验方法  31-36
    2.2.1 基因组DNA提取、纯化与定量  31-34
      2.2.1.1 桉树叶片总DNA的提取  31-33
      2.2.1.2 桉树叶片基因组DNA的纯化  33
      2.2.1.3 桉树叶片基因组DNA的质量检测  33-34
      2.2.1.4 桉树叶片基因组DNA的浓度及纯度测定  34
    2.2.2 ISSR-PCR扩增  34-36
      2.2.2.1 ISSR反应体系的优化  34-35
      2.2.2.2 ISSR产物鉴定  35-36
      2.2.2.3 引物筛选  36
      2.2.2.4 数据统计与处理  36
  2.3 结果与分析  36-53
    2.3.1 桉树基因组DNA的提取及质量检测  36-38
    2.3.2 ISSR反应体系的建立及优化  38-42
      2.3.2.1 模板浓度  38
      2.3.2.2 Taq酶用量  38-39
      2.3.2.3 Mg~(2+)浓度  39-40
      2.3.2.4 dNTPs浓度  40-41
      2.3.2.5 引物浓度  41
      2.3.2.6 退火温度  41-42
      2.3.2.7 优化的ISSR-PCR体系  42
    2.3.3 ISSR-PCR扩增结果  42-43
    2.3.4 桉树的遗传距离和遗传一致度分析  43-44
    2.3.5 桉树4种源18个样品的亲缘关系聚类分析  44-48
    2.3.6 桉树4种源18个品种的遗传分化的主坐标排序分析  48-52
    2.3.7 小结  52-53
3 基于ISSR的桉树STS标记的开发初探  53-62
  3.1 实验方法  53-56
    3.1.1 ISSR-PCR扩增特异性条带回收  53
    3.1.2 制备感受态细胞  53-54
    3.1.3 T载体连接  54-55
    3.1.4 质粒转化感受态细胞  55
    3.1.5 重组子的PCR鉴定  55-56
  3.2 结果与分析  56-61
    3.2.1 ISSR-PCR扩增特异条带的T-A克隆及鉴定  56-57
    3.2.2 引物设计  57-58
    3.2.3 STS标记的引物筛选  58-61
  3.3 小结  61-62
4 结论与讨论  62-63
参考文献  63-73
附录A:12种引物对桉树ISSR扩增的电泳结果  73-76
附录B:实验药品  76-78
附录C:基于ISSR的STS扩增引物及序列  78-80
附表D:ISSR扩增序列的Blast比对结果  80-83
攻读学位期间的主要学术成果  83-84
致谢  84

桉树4个种遗传多样性的ISSR分析及STS标记开发初探

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