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AHR/ARNT元件抑制GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达
作 者: 赖宁
导 师: 李冰
学 校: 广州医学院
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC) 转录调控 AHR/ARNT元件 大鼠支气管上皮细胞(RTE)
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
谷胱甘肽(GSH)是体内重要的抗氧化、抗炎物质,对保护组织器官免受氧化损伤具有重要作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是合成GSH的限速酶,其催化亚单位GCLC具有全酶的催化活性。对于该酶基因表达调节的了解能够有助于在分子水平阐明GSH变化的机制。我们前期的研究发现, GCLC基因上游调控序列存在一个转录抑制区域,其中两个E-box元件(-804~-799,-729~-724)在大鼠多种组织来源的细胞中起负性调控作用,并且具有组织特异性。文献报道和我们的实验结果均提示E-box元件具有双向调控的性质,这一特点与旁侧元件的组成以及结合的转录因子有关。为此我们分析了大鼠GCLC基因上游调控序列中与E-box元件相邻的元件,其中AHR/ARNT元件引起我们的关注。该基因上游存在两个核心序列同为CACGGG的AHR/ARNT元件,其中一个(-1090~-1085)位于E-box元件附近。其结合的转录因子芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)是许多bHLH-PAS蛋白共同的专性二聚化配偶体,其中包括芳香烃受体(AHR)、低氧诱导因子(HIF)1α和2α、SIM蛋白等,参与机体内许多重要的生物学过程。由于有报道指出转录因子ARNT能够与E-box元件的结合蛋白USF1/2形成异源二聚体,使得E-box元件与ARNT之间相互作用的假设在理论上具有可信性,并且由于其结合的转录因子与低氧、毒物代谢等生命活动相关,故如果该关系存在,就可能解释众多关于细胞应激以及氧化-抗氧化平衡等问题。为此本研究首先对这两个AHR/ARNT元件在大鼠的GCLC基因转录中是否具有调控作用进行了系统分析。目的探讨位于转录起始位点上游-1090~-1085与-215~-210bp处的两个AHR/ARNT元件对RTE细胞内的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)是否具有转录抑制作用,从而了解γ-GCS基因转录调节特征。方法1、报道载体以及真核表达载体的构建:(1)缺失AHR/ARNT元件报道载体:单缺失AHR/ARNT元件报道载体的构建是以GCLC-luc ( -1758~+2)为模板,按照引物导入核心序列缺失的方法,通过两次PCR扩增出缺失-1090~-1085或-215~-210的AHR/ARNT元件的片段。两种PCR产物胶回收后连入pGEM-T easy载体,以Sac I/Xho I双酶切插入pGL3-enhancer载体鉴定并测序。双元件缺失载体GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc的构建是以GCLC-delAHR/ARNT(-1090)-Luc为模板进行两轮PCR扩增,其余步骤与上述相同。(2)AHR/ARNT元件核心与相邻序列报道载体:合成含有核心序列并包括相邻序列的AHR/ARNT(-1090)和AHR/ARNT(-215)正义和其反向互补链,预留Sac I/Xho I酶切位点,采用逐渐退火的方法使两条单链互补配对,然后利用这两个位点按常规分子克隆技术将片段克隆入pGL3-promoter载体。(3)真核表达质粒:按Invitrogen公司的Trizol试剂提供的方法提取大鼠肝脏总RNA,使用逆转录试剂合成大鼠肝脏cDNA,PCR扩增出AHR、AHRR、ARNT2、ARNT片段。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收后连入pGEM-T easy载体,Hind III/Not I双酶切鉴定并测序。测序正确目的基因片段按照常规克隆技术连入pRc/CMV2载体并测序证实。2、调控序列的细胞内促转录活性的测定:将GCLC-Luc、单缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc、双缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc、PGL3-Promoter以及含有AHR/ARNT元件核心与旁侧序列的报告基因载体转染大鼠RTE细胞,检测转染后细胞的萤光素酶活性值,来判断AHR/ARNT元件对GCLC基因转录活性的影响。3、与AHR/ARNT元件可能结合的转录因子过量表达实验:将GCLC-Luc、缺失AHR/ARNT元件和双缺失AHR/ARNT元件的报告基因载体分别与四种真核表达质粒AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2-CMV2共转染大鼠RTE细胞,通过增强AHR/ARNT元件与可能和该元件结合的反式作用因子的作用,观察其对GCLC基因转录活性的影响。4、电泳迁移率变动分析实验(EMSA)以及Supershift:观察在RTE细胞中AHR/ARNT元件是否有核蛋白特异性结合,并用Supershift检测其结合的转录因子是否是前期实验所推测的转录因子AHR以及ARNT。结果1、成功构建含GCLC上游启动子序列分别单缺失AHR/ARNT元件(-1090~-1085以及-215~-210 )的报告基因载体( GCLC-delAHR/ARNT(-1090)-luc、GCLC-delAHR/ARNT(-215)-luc ),双缺失AHR/ARNT元件的报告基因载体(GCLC-DdelAHR/ARNT-Luc),含有AHR/ARNT元件核心与旁侧序列的报告基因载体(AHR/ARNT(-1090)-Promoter以及AHR/ARNT(-215)-Promoter)以及真核表达载体AHR-CMV2、AHRR-CMV2、ARNT-CMV2、ARNT2-CMV2。2、实验中将GCLC-Luc及其定点缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc以及PGL3-Promoter、AHR/ARNT(-1090)-Promoter和AHR/ARNT(-215)-Promoter转染大鼠支气管上皮细胞(RTE) ,结果表明缺失AHR/ARNT元件(-1090~-1085)的GCLC基因5’-上游序列的转录活性明显高于野生型基因5’-上游序列,GCLC-delAHR/ARNT(-1090)-luc在细胞内萤光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.16倍;而缺失两个AHR/ARNT元件的效果与缺失上述元件相同,GCLC-DdelAHR/ARNT-luc萤光素酶活性水平是GCLC-Luc的2.21倍,两者均差异显著(均P<0.05);转染AHR/ARNT(-1090)-Promoter的萤光素酶值明显高于转染PGL3-Promoter的萤光素酶值,是PGL3-Promoter的2.61倍(P<0.05)。实验结果说明AHR/ARNT元件(-1090~-1085)在RTE细胞中具有转录调节活性,而在GCLC基因的基础状态下的转录表达中起抑制作用。3、将AHR-CMV2和GCLC-Luc以及单缺失或双缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共转染RTE细胞的萤光素酶值与CMV2空载体和GCLC-Luc以及单缺失或双缺失AHR/ARNT元件的GCLC-Luc共转染RTE细胞的萤光素酶值进行比较。结果提示GCLC-luc和CMV2空载体共转染的萤光素酶值是GCLC-luc和AHR-CMV2共转染的萤光素酶值的2.37倍(P<0.05)。这说明转录因子AHR的过表达对GCLC基因具有负性调控作用,而其它转录因子AHRR、ARNT以及ARNT2的过表达对GCLC基因不具有明显调控作用。4、电泳迁移率变动分析(EMSA)以及Supershift结果显示GCLC基因上游调控区域的两个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT。结论GCLC基因-1090~-1085区段功能元件AHR/ARNT在大鼠GCLC基因中属抑制元件,在GCLC基因基础状态表达中起负调控作用。
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全文目录
中英文对照词汇表 3-4 中文摘要 4-8 Abstract 8-12 前言 12-17 第一部分 各种缺失AHR/ARNT元件的萤光素酶报告载 体以及各种真核表达载体的构建与鉴定 17-40 材料和方法 17-33 结果 33-37 讨论 37-40 第二部分 AHR/ARNT 元件对大鼠GCLC 基因表达调控活性的影响 40-58 材料和方法 40-50 结果 50-55 讨论 55-58 结论 58-59 参考文献 59-64 附图 64-80 学习期间发表的论文 80-81 致谢 81-82
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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