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CD147启动子CpG岛甲基化的初步研究

作　者: 孔令敏
导　师: 陈志南
学　校: 第四军医大学
专　业: 细胞生物学
关键词: CD147 启动子 甲基化 肝细胞肝癌 转录调控 亚硫酸氢钠
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC),是亚洲与非洲地区的高发肿瘤,发病率与病死率之比为1:0.98。我国每年约12万人死于肝癌,占全球肝癌病人死亡人数的44%,位于我国恶性肿瘤死亡率第二位,因此防治肝癌成为肿瘤研究的重要课题。CpG岛局部甲基化的异常变化往往早于细胞的恶性增生,全基因组的低甲基化伴随癌症的发生而出现,且随着肿瘤恶性程度的增加而更加明显,因此对DNA甲基化的检测可用于肿瘤诊断和预后评估,是癌症研究的热点之一。我们多年对肝癌的研究表明,CD147是一个高表达于肝癌组织的膜蛋白,与肝癌等恶性肿瘤的侵袭转移有着密切的关系。CD147可以通过诱导MMPs分泌降解细胞外基质促进肿瘤侵袭转移,还可以通过VEGF、uPA、抑制失巢凋亡等途径促进肿瘤增殖转移,因此CD147是一个重要的癌生物标志物,对肝癌等恶性肿瘤诊断、预防及治疗都有着极其重要的意义。基于已经证实的CD147启动子区存在CpG岛这一现象,研究CD147启动子区CpG岛甲基化状态及其与肝癌的相关性,探讨甲基化对CD147的转录调控,对于理解肝癌的发生发展、早期诊断和靶向治疗有着重要的应用价值。本课题的研究目标有三点:首先确定CD147启动子区CpG岛是否存在甲基化现象,并参与CD147的转录调控;其次,分析CD147启动子区CpG岛,确定可能存在甲基化的CG二核苷酸,了解各个甲基化位点在正常及肿瘤细胞系中的甲基化状态;最后通过检测肝癌样本中甲基化状态来分析甲基化与肝癌的相关性,评价甲基化检测用于肝癌辅助诊断的可行性。相应研究分三部分:(1)通过流式细胞术和realtime RT-PCR技术检测CD147在不同肝癌细胞系和正常肝细胞系的表达情况;确定去甲基化试剂5-氮脱氧胞苷的作用浓度和时间,用realtime RT-PCR技术检测5-氮脱氧胞苷处理各细胞系后CD147表达情况;(2)用pBluescript SK质粒优化Bisulfite处理步骤,提取细胞系基因组DNA并用Bisulfite处理,PCR扩增处理后的启动子区基因,克隆测序确定不同细胞系CD147启动子区甲基化位点;(3)提取正常肝、胎肝、正常人外周血及肝癌和癌旁蜡块标本的基因组DNA,Bisulfite处理后用克隆测序的方法检测不同组织CD147启动子区甲基化状况。在本课题中,我们确定了5-Aza-DC的作用浓度为5μM,realtime RT-PCR的反应体系、循环温度等参数。结果显示,在肝癌细胞系中CD147表达量显著高于正常肝细胞系。经5-Aza-DC处理后CD147的表达上调,尤其表现在低表达CD147的细胞系如正常肝细胞QZG和癌旁细胞上,提示在CD147启动子区存在着甲基化的位点,抑制甲基化可能会上调CD147的表达。确定了Bisulfite的最佳处理条件,通过亚硫酸盐克隆测序的方法检测了CD147启动子区转录起始位点上游-200bp的甲基化状况。在正常肝细胞系和肝癌细胞系中甲基化水平存在显著性差异(P=0.004),上皮来源的肿瘤细胞系和上皮来源的正常细胞系甲基化水平也存在显著差异(P=0.009),在肝癌细胞系存在着普遍低甲基化现象。检测肝癌蜡块标本、正常肝及正常人外周血白细胞,结果显示正常肝和正常人外周血CD147启动子区呈高甲基化状态,而在肝癌和癌旁普遍呈低甲基化状态。甲基化程度是:肝癌<癌旁<正常肝,可见在肝癌的发生过程中CD147的甲基化程度在不断降低。在胎肝中CD147甲基化程度较低,提示在胚胎发育过程中CD147也受到甲基化的调控。根据上述结果,我们证实了CD147启动子区CpG岛存在甲基化的现象,并参与CD147的转录调控。从正常肝到肝癌,甲基化水平不断下降,这些结果有助于我们深入理解肝癌发生发展的分子机制。检测CD147基因启动子甲基化状态,可用于肝癌的辅助诊断、监测肝癌患者的预后及治疗反应。针对CD147甲基化进行干预治疗,发展肿瘤治疗的新策略。

全文目录


缩略语中英文对照表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-14
文献回顾  14-41
  1 DNA甲基化研究进展  14-33
  2 CD147分子的研究进展  33-41
实验内容  41-84
  第一部分 Realtime RT-PCR检测CD147在肝癌细胞系的差异表达及5-氮脱氧胞苷处理后其表达变化  41-56
    1 实验材料  41-43
    2 方法  43-47
    3 实验结果  47-52
    4 讨论  52-56
  第二部分 CD147启动子区甲基化位点的确定  56-74
    1 实验材料  56-58
    2 方法与步骤  58-66
    3 结果  66-73
    4 讨论  73-74
  第三部分 CD147甲基化与肝癌相关性的研究  74-84
    1 实验材料  74-76
    2 方法与步骤  76-79
    3 结果  79-82
    4 讨论  82-84
小结  84-85
参考文献  85-97
附录  97-104
个人简历和研究成果  104-105
致谢  105

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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