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缺氧环境下GDDR的下调易化VEGF在胃癌细胞的表达

作　者: 祁胜宾
导　师: 杜建军；卢兹凡
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 胃肿瘤 GDDR 启动子 HIFs VEGF 低氧微环境转录调控抑癌基因
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:通过检测GDDR mRNA的表达变化,研究低氧环境对GDDR的转录调控,并探讨其可能的机制以及GDDR下调与肿瘤发生发展的相关性。胃癌细胞系转染GDDR表达质粒,观察低氧环境下GDDR对VEGF表达的影响;在正常胃黏膜细胞系应用siRNA干涉GDDR表达,观察VEGF表达情况,探讨GDDR在肿瘤血管生成过程中抑制肿瘤生长的作用。方法:本研究通过启动子双荧光素酶报告系统和Real time PCR实验,观察CoCl₂模拟低氧环境模型和细胞低氧孵箱培养模型中GDDR表达变化及其机制;并通过酶联免疫反应吸附试验（ELISA）和Real time PCR实验研究GDDR表达变化在低氧条件下对VEGF转录和翻译的影响。本研究的主要结果如下:1.成功克隆得到人GDDR基因的启动子片段,并将其连入双荧光素酶报告质粒pGL3-Basic中。测序正确后,转染细胞检测发现重组的pGL3-GDDR-Promoter质粒具有启动子活性,可作为GDDR转录调控机制研究的有效工具。2.通过共同转染pGL3-GDDR-Promoter质粒和pcDNA3.1-HIFs表达质粒,发现转录因子HIFs对GDDR基因有转录抑制作用。低氧诱导因子（hypoxia-inducible factors HIFs）在肿瘤发展过程中调控众多靶基因,由此本实验用CoCl2模拟低氧环境,通过Real time PCR方法检测到GDDR基因mRNA转录的下调,进一步在低氧孵箱培养GES-1细胞,行Real time PCR实验证实:低氧环境诱导的HIFs下调GDDR基因的转录表达。3.血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）是HIFs主要的靶基因之一。在CoCl2模拟低氧环境下,应用Real time PCR实验和免疫酶联反应（ELISA）实验发现VEGF在转录和翻译水平表达升高;在低氧孵箱培养细胞模型中得到了相同的结果。说明成功构建两种低氧环境的模型,并能使VEGF的表达升高。4.在成功建模的基础上,低氧环境下培养低表达GDDR基因的SGC-7901细胞系和稳定表达GDDR基因的SGC-7901细胞系,分别检测VEGF在转录和翻译水平表达变化情况发现:GDDR基因表达下调或和缺失的细胞系中VEGF的表达水平显著高于GDDR基因高表达的细胞系,VEGF的表达升高表现在转录和翻译水平。5.为了进一步研究GDDR基因对VEGF的表达变化的影响,实验设计了GDDR基因的siRNA,通过Real time PCR反应证实siRNA的干涉效率满足实验要求。在GDDR基因表达相对较高的GES-1细胞系干涉其表达发现:正常胃黏膜细胞系GES-1细胞中GDDR基因表达下调时,VEGF在转录和翻译水平表达均升高。结论:本课题组首次发现在低氧环境下GDDR基因mRNA水平的下调。体外细胞试验发现:转录因子HIFs一方面促进VEGF表达升高使发挥其促肿瘤作用,另一方面转录因子HIFs又能下调GDDR基因的表达,而下调表达的GDDR基因又能易化VEGF的表达,加剧肿瘤的发展速度。肿瘤发生过程中低氧微环境下调GDDR表达,此结果通过VEGF表达升高使血管生成这一肿瘤发生行为得到发展。此外,研究表明肿瘤细胞中GDDR基因下调或和缺失表达。这些证据提示GDDR基因具有抑制肿瘤发生的生物学效应。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-16
文献回顾  16-33
  GDDR 的研究进展  16-18
  低氧诱导因子(hypoxia-in-ducible factors,HIFs)  18-27
  血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)  27-33
第一部分 HIFs 对人GDDR 基因抑制作用  33-48
  实验一人GDDR 基因启动子的克隆、报告基因载体构建  33-37
    1 材料、试剂与仪器  33-34
    2 方法  34-35
    3 结果  35-36
    4 讨论  36-37
  实验二利用双荧光素酶报告系统检测HIFs对人GDDR基因的抑制作用  37-41
    1 材料、试剂与仪器  37-38
    2 方法  38-39
    3 结果  39-40
    4 讨论  40-41
  实验三在人胃粘膜 GES-1 细胞中过表达 HIFs 质粒,人 GDDR 基因 mRNA 转录受到抑制  41-48
    1 材料、试剂与仪器  41-42
    2 方法  42-45
    3 结果  45-46
    4 讨论  46-48
第二部分缺氧环境下人GDDR 基因mRNA 表达下调  48-55
  实验一 CoC1_2模拟低氧条件下人GDDR基因mRNA表达下调  48-52
    1 材料、试剂与仪器  48-49
    2 方法  49
    3 结果  49-50
    4 讨论  50-52
  实验二低浓度氧环境下GDDR 基因表达下调  52-55
    1 材料、试剂与仪器  52-53
    2 方法  53
    3 结果  53-54
    4 讨论  54-55
第三部分低氧环境GDDR 下调对VEGF 表达的易化作用  55-72
  实验一低氧条件下人VEGF 基因转录和翻译水平表达的升高  55-63
    1 材料、试剂与仪器  55-56
    2 方法  56-60
    3 结果  60-61
    4 讨论  61-63
  实验二稳定表达GDDR 基因的胃癌细胞系在低氧条件下 VEGF转录和翻译受到抑制  63-68
    1 材料、试剂与仪器  63
    2 方法  63-65
    3 结果  65-67
    4 讨论  67-68
  实验三应用siRNA 干涉GDDR 基因后VEGF 转录和翻译升高  68-72
    1. 材料、试剂与仪器  68-69
    2 方法  69
    3 结果  69-71
    4 讨论  71-72
小结  72-73
参考文献  73-85
个人简历和研究成果  85-86
致谢  86-87

缺氧环境下GDDR的下调易化VEGF在胃癌细胞的表达

内容摘要

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