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人毛乳头细胞CCDC72基因的表达及启动子活性分析

作　者: 孙丽华
导　师: 郝飞
学　校: 第三军医大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 毛囊毛乳头毛乳头细胞凝集性生长 CCDC72 启动子基因表达基因克隆转录调控
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

毛囊是毛发的主体,是一个典型的再生系统,从胚胎期发生后就伴随个体一生并周而复始地循环。毛发具有许多有益的生物学功能和重要的社会心理学作用,因毛发生长异常而发生的少毛或多毛现象不仅影响毛发生理功能的正常发挥,而且使患者承受极大的心理压力,影响他们的健康和生活质量。因此,弄清毛发胚胎期发生、生长周期调控机制及毛囊生长期基因的表达变化,开发有效治疗毛发疾病的药物是目前毛囊生物学研究的热点。位于毛囊基底部的毛乳头是一个可诱导毛囊生长的结构,它能发送或接受信号,从而影响毛囊的发育和周期性生长。毛乳头细胞是组成毛乳头的唯一细胞,是胚胎期诱导毛囊形成和成熟毛囊完成周期性循环的主要调节细胞。凝集性生长是毛乳头细胞的重要生物学特性之一,凝集性生长与毛乳头细胞的功能和分化状态有关。但是毛乳头细胞凝集性生长的分子机制不明,同时凝集性生长状态下毛乳头细胞所表达的基因在毛囊发育和毛囊周期性生长调控中的作用也少有研究。凝集性生长状态的DPC仍然保持诱导毛囊发生的能力。为了探索哪些基因在DPC凝集性生长状态下表达,筛选与DPC凝集生长相关的基因,宋志强等通过抑制性消减杂交技术建立了人类DPC消减cDNA文库,并从凝集生长状态的DPC筛选出一批表达上调和表达下调基因。CCDC72即是通过上述方法筛选出的与DPC凝集性生长相关基因,它首次从CD34+造血干细胞/祖细胞( CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC)中被分离鉴定,但功能不清。王继文等通过RNA干扰技术使CCDC72基因在DPC内的表达下降或消失,结果显示CCDC72表达阴性后的DPC生长速度明显减慢并失去凝集性生长特性,细胞形态也发生了显著的改变。夏汝山等发现CCDC72重组蛋白能促进高传代DPC的增殖及DNA的合成。这些结果表明CCDC72对调节DPC生长及其分化至关重要,是毛囊生长期维持DPC处于功能状态的重要基因之一。基于以上认识,本课题拟对CCDC72基因在DPC中的基因表达、蛋白定位和启动子活性进行实验研究。1、两步酶消化法是一种快速、简单、经济的分离培养毛乳头细胞的方法。我们首先从人头皮毛囊分离培养人毛乳头细胞,这些细胞具有周期性凝集性生长特性,而且这种特性随着传代次数的增多而逐步丧失。2、利用细胞免疫荧光和还原型线粒体特异性荧光探针MitoTracker Red CM-H2X Ros,结合激光共聚焦显微镜技术发现CCDC72蛋白位于胞浆内,可能定位于线粒体上。通过荧光半定量Real-time PCR发现随着DPCs传代数的增加,CCDC72基因mRNA的表达呈下降趋势,1～3代DPCs中CCDC72mRNA的表达稳定且显著高于4～8代,4～6代DPCs中CCDC72mRNA的表达又显著高于第8代。3、运用在线软件Cister对CCDC72基因5’端2000bp进行启动子特征分析表明其5’侧翼区的主要特点是在-200～-1bp及-1000～-600bp两段区域间顺式作用元件呈高频分布。根据上述结果从5’端逐步缺失,成功构建4个5’端不等,3’端平齐的启动子荧光素酶报告基因载体,分别转染第3代和第8代的DPCs中,采用双荧光素酶报告系统对荧光素酶表达量进行检测。结果显示:在第3代DPCs中,这四个不同长度启动子重组pGL3-Basic载体荧光素酶活性较pGL3-Basic空载体明显增强,pGL3-B-604的荧光素酶活性最强。在第8代DPCs中,4个重组pGL3-Basic载体荧光素酶活性均较第3代DPCs的明显降低,pGL3-B-1924荧光素酶活性与pGL3-Basic空载体无差异,pGL3-B-204、pGL3-B-604、pGL3-B-1004均显著高于pGL3-Basic空载体,pGL3-B-204的荧光素酶活性最强,可能是最小核心启动子所在区域,维持了基础转录活性。在第3代DPCs中,pGL3-B-604的荧光素酶活性最强,而在第8代DPCs中,pGL3-B-604的荧光素酶活性明显降低,提示DPCs在传代过程中,可能是通过-600～-200bp之间的调控元件发挥转录调控的作用。

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英文缩略语注释  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-11
论文正文人毛乳头细胞CCDC72 基因的表达及启动子活性分析  11-59
  前言  11-14
  第一部分 DPC 分离、培养及生长特性观察  14-22
    实验材料  14-15
    实验方法  15-17
    实验结果  17-20
    讨论  20-22
  第二部分 CCDC72 蛋白的细胞内定位及基因表达分析  22-32
    实验材料  22-23
    实验方法  23-26
    实验结果  26-30
    讨论  30-32
  第三部分 CCDC72 基因启动子的克隆及活性分析  32-52
    实验材料  32-34
    实验方法  34-43
    实验结果  43-49
    讨论  49-52
  全文总结  52-53
  致谢  53-54
  参考文献  54-59
文献综述毛乳头细胞生物学特性研究进展  59-66
  参考文献  64-66
在读硕士学位期间撰写论文  66

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