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长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌的耐药特征及femB基因的克隆和原核表达

作　者: 武文君
导　师: 邹明祥
学　校: 中南大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 金黄色葡萄球菌耐药性药物敏感性实验 femB基因原核表达
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的(1)了解长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)对常用抗菌药物的耐药现状,探讨金黄色葡萄球菌对甲氧西林和万古霉素的耐药水平。(2)构建金葡菌甲氧西林耐药辅助基因femB的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,为进一步研究金葡菌对甲氧西林的耐药机制奠定基础。方法(1)收集长沙地区11家医院2009年11月-2010年11月临床分离的非重复金葡菌279株,应用Vitek-2全自动微生物分析系统进行鉴定,K-B法检测金葡菌对24种药物的敏感性,产色头孢菌素试验检测β-内酰胺酶以及D试验检测诱导型克林霉素耐药。(2)应用头孢西丁和苯唑西林纸片扩散法筛查耐甲氧西林的金葡菌(MRSA);琼脂稀释法检测头孢西丁,苯唑西林和万古霉素的最低抑菌浓度(MIC)。(3)提取金葡菌基因组DNA,并以此为模板进行femB基因的PCR扩增,构建重组质粒pGEX-4T-1-femB,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21中进行表达。采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证。结果(1)279株分离的金葡菌对24种药物的耐药分析显示,敏感率>50%的药物为9种,敏感率最高的为万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺,均为100%,其次为呋喃妥因(97.1%)、氯霉素(93.5%)和复方新诺明(87.1%)。耐药率>50%的抗菌药物有11种,其中以青霉素G和氨苄西林的耐药率最高,均为97.1%。MRSA的分离率为54.5%,除万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺、呋喃妥因均高度敏感外,MRSA对常用的16种抗生素的耐药率均显著高于MSSA。(2) 279株金黄葡菌中,p-内酰胺酶阳性250株(89.6%),红霉素耐药而克林霉素敏感、中介的30株菌中,D试验阳性22株(73.3%)。(3)苯唑西林(OXA)和头孢西丁(FOX) MIC范围分别为O.125μg/ml～>256μg/ml和2μg/ml～>256μg/ml,苯唑西林的MIC50和MIC90分别为128μg/ml和256μg/ml,头孢西丁的MIC50和MIC90分别为64μg/ml和256μg/ml。万古霉素MIC范围为1～2μg/ml,MIC50和MIC90均为2μg/ml。(4)经PCR,双酶切以及测序验证,成功的构建了重组质粒pGEX-4T-1-femB;重组质粒转化大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析证实表达出49KDa目的蛋白。结论(1)长沙地区临床分离的金葡菌p-内酰胺酶阳性率,克林霉素诱导型耐药率均较高,且呈多重耐药特征。(2)长沙地区临床分离的金葡菌不仅MRSA分离率高,而且对甲氧西林呈高水平耐药；所有菌株对万古霉素均敏感,但MIC已接近中介水平,应引起高度重视。(3)成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-femB,并在大肠杆菌中高效的表达。

长沙地区临床分离金黄色葡萄球菌的耐药特征及femB基因的克隆和原核表达

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