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分枝杆菌菌种鉴定及北京家族蛋白质组学初步研究

作　者: 李艳冰
导　师: 刘文恩；万康林
学　校: 中南大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 非结核分枝杆菌 脓肿分枝杆菌 PCR-RFLP 结核分枝杆菌北京家族 蛋白质组学
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的初步鉴定我国致病性非结核分枝杆菌(NTM)、龟-脓肿分枝杆菌复合群的菌种；探讨分枝杆菌快速分子鉴定技术。初步分析结核分枝杆菌(MTB)北京家族和卡介苗(BCG)的蛋白质组及其差异。方法用L-J和PNB/TCH培养基对经地方实验室鉴定为NTM的临床菌株复核鉴别后,用hsp65和rpoB PCR-RFLP对NTM分类鉴定；用细菌学、探针杂交和以16s rRNA、16s-23s rRNA、rpoB、hsp65、recA和sodA为靶标的多靶位技术对龟-脓肿分枝杆菌复合群进行亚种鉴定。蛋白质组研究采用双向凝胶电泳和质谱技术。结果复核鉴定178株菌株中MTB 27株、牛分枝杆菌1株和NTM150株。NTM中胞内分枝杆菌72株、脓肿分枝杆菌群27株、戈登分枝杆菌12株、鸟分枝杆菌11株、偶发分枝杆菌9株、堪萨斯分枝杆菌2株、猿分枝杆菌1株、冬天分枝杆菌1株、M. arupense 1株和未定种14株。脓肿分枝杆菌群中脓肿分枝杆菌19株、马赛分枝杆菌3株和鉴定出龟-脓肿复合群新亚种(福建分枝杆菌)5株。分析了北京家族菌株765个蛋白质点,发现了6种特有蛋白质和2种表达明显增加的蛋白质。结论中国NTM肺病病原种类繁多,以胞内分枝杆菌群和龟-脓肿分枝杆菌复合群为主。龟-脓肿分枝杆菌复合群至少含有三种亚种,并首次发现了龟-脓肿分枝杆菌复合群福建分枝杆菌。多靶位分子检测技术联合能有效对NTM进行种和亚种鉴定。北京家族与BCG蛋白组间存在明显差异。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
缩略词表  10-11
前言  11-14
第一部分 分枝杆菌菌种鉴定技术研究  14-48
  第一章 前言  14-15
  第二章 材料与方法  15-24
    2.1 材料  15-17
      2.1.1 临床菌株  15
      2.1.2 标准菌株  15
      2.1.3 主要试剂  15-17
      2.1.4 主要仪器  17
    2.2 方法  17-24
      2.2.1 细菌学鉴定  17-18
      2.2.2 分子生物学鉴定  18-21
      2.2.3 杂交法菌种鉴定  21-22
      2.2.4 生长及生化特性鉴定  22-24
  第三章 结果  24-41
    3.1 细菌学鉴定结果  24-25
    3.2 分子生物学鉴定结果  25-37
      3.2.1 hsp65及rpoB基因扩增结果  25-26
      3.2.2 hsp65 PCR-RFLP及rpoB PCR-RFLP结果  26-28
      3.2.3 27株脓肿分枝杆菌群菌株hsp65 PCR-RFLP与rpoB PCR-RFLP鉴定结果比较  28-30
      3.2.4 hsp65、rpoB、16s rRNA、its、sodA及recA基因测序及比对结果  30-32
      3.2.5 聚类分析结果  32-35
      3.2.6 基因多序列比对及酶切位点序列分析结果  35-37
    3.3 杂交法鉴定结果  37
    3.4 生长及生化特性鉴定结果  37-40
    3.5 龟-脓肿分枝杆菌复合群新亚种鉴定总结  40-41
  第四章 讨论  41-47
    4.1 NTM鉴定复核结果  41
    4.2 临床分离NTM鉴定结果  41-43
      4.2.1 我国临床分离NTM的流行病学情况  41-42
      4.2.2 菌种鉴定的临床意义  42-43
    4.3 脓肿分枝杆菌群菌种鉴定结果  43-44
    4.4 首次发现龟-脓肿分枝杆菌复合群新亚种(福建分枝杆菌)  44-47
  第五章 小结  47-48
第二部分 结核分枝杆菌北京家族蛋白质组学初步研究  48-63
  第一章 前言  48
  第二章 材料与方法  48-57
    2.1 材料  48-52
      2.1.1 菌株  48
      2.1.2 主要试剂  48-52
      2.1.3 主要仪器  52
    2.2 方法  52-57
      2.2.1 细菌培养  52
      2.2.2 提取菌体蛋白  52
      2.2.3 菌体蛋白纯化  52-53
      2.2.4 蛋白浓度测定  53-54
      2.2.5 第一向等电聚焦  54
      2.2.6 胶条平滑  54-55
      2.2.7 二向分离SDS-PAGE  55
      2.2.8 考马斯亮兰染色  55
      2.2.9 图像采集与分析  55
      2.2.10 切点  55
      2.2.11 MALDI-TOF  55-57
  第三章 结果  57-59
    3.1 双向凝胶电泳结果  57
    3.2 MALDI-TOF-MS质谱分析及数据库搜集  57-59
  第四章 讨论  59-62
  第五章 小结  62-63
参考文献  63-68
综述  68-78
  参考文献  75-78
附录  78-91
  附录1 178株临床分离抗酸杆菌L-J、PNB/TCH培养基生长鉴别试验鉴定结果  78-82
  附录2 hsp65 PCR-RFLP及rpoB PCR-RFLP菌种鉴定结果  82-89
  附录3 27株龟-脓肿分枝杆菌复合群菌种多靶位基因比对结果表  89-91
致谢  91-92
攻读学位期间发表论文及参与的研究  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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