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RNA干扰J亚群禽白血病病毒跨膜蛋白（TM）表达对病毒复制的影响

作　者: 刘青
导　师: 成子强
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: J亚群禽白血病病毒 RNAi siRNA 体内试验体外实验
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

禽白血病(avian leukosis,AL)是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病,可划分为A-J 10个亚群,其中禽白血病J亚群病毒(ALV-J)是由内源性和外源性ALV重组而来,自发现以来给养禽造成了巨大的经济损失。至目前为止,无任何可预防和治疗的药物。为减轻该病毒对养鸡业的危害,探索合适的预防和治疗方法成为生产上亟待解决的问题。根据反转录病毒入侵细胞采用膜融合机制这一特点,本研究采用RNA干扰(RNAi)技术,特异地阻断膜融合的关键基因表达沉默,以切断病毒入侵宿主细胞途径,达到抗病毒目的。ALV-J与受体结合后通过gp37基因编码的跨膜蛋白(TM)构象的变化实现膜融合过程,因此我们以gp37为靶向基因设计合成6对短的双链RNA(siRNA),克隆到psilence2.1-U6载体上命名为pu6gp37-1,pu6gp37-2,pu6gp37-3, pu6 gp37-4,pu6gp37-5,pu6gp37-6, pu6gp(阴性对照)。分别在CEF及1日龄SPF雏鸡上进行干扰实验以检测对病毒复制的影响。结果显示siRNA无论在体内还是体外,对ALV-J的增殖都起到了抑制作用。这为抗ALV-J siRNA药物的临床应用奠定了坚实的基础,并为其它病毒病的防治提供了可借鉴的方法。pEGFP-N1真核细胞表达载体携带有绿色荧光蛋白报告基因,将携带gp37基因的pEGFP- gp37融合表达载体转染CEF,分别在24h, 48h,72h观察荧光的变化。发现转染后24h就可见到荧光,48h荧光最强,随后逐渐减弱;将pEGFP- gp37与构建的针对gp37基因不同区域的siRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞48h后观察,可见与pu6gp37-2、pu6gp37-4质粒共转染组荧光减弱且荧光细胞数减少,初步验证pu6gp37-2、pu6gp37-4抑制了gp37基因在CEF中的表达。将pu6gp37-2、pu6gp37-4、pu6gp转染CEF,8h后接入ALV-J NX0101毒株,5d后用间接免疫荧光检查细胞感染状况,荧光显微镜下可见pu6gp37-2、与pu6gp组荧光细胞数及强度相近,而pu6gp37-4组明显减少减弱,说明该组病毒增殖受到抑制。pu6gp37-4干扰作用的发挥与其序列位置有关,它列位于膜外区与免疫抑制区紧紧相连,此段序列的沉默不仅可以抑制病毒与宿主细胞的融合,也会减轻病毒感染所产生的免疫抑制。体内试验共设置治疗组(先接毒后注射siRNA)和预防组(先注射siRNA后接毒)两大方向组,组内根据接种剂量和途径又分为高剂量、低剂量及连续注射siRNA组,连同阳性对照组及阴性对照组,本实验共分为8个试验组。1日龄接种后,每周剖检1次,共进行4次。通过对体重、免疫器官重量、血液学指标(抗原、抗体、血液细胞数)、胸腺CD4+、CD8+T淋巴细胞变化及病原的连续检测以检测动物体内RNAi ALV-J复制的作用。对4次剖检样品的血清进行ALV-J抗体检测全部为阴性,说明鸡群均处于病毒血症状态,对后2次剖检样品棉拭子进行ALV-J抗原p27检测,所有攻毒鸡群抗原均呈现阳性,且先攻毒组的OD值要大于后攻毒组,证明实验模型的成功建立。对其他各项指标的4次检测结果进行分析可以看出,预防低剂量组可以有效地缓解病毒对体重、胸腺、脾脏、法氏囊发育的抑制,5周龄时其重量分别为阳性对照组的1.5倍、6.7倍、6.5倍、1.9倍。治疗组保护作用没有预防组显著。用流式细胞仪对该组T淋巴细胞亚群分析结果为,CD4+T淋巴细胞高于阳性对照组并接近阴性对照组数值,说明病毒对免疫器官没有造成太大损伤。血细胞分析仪对白细胞数、淋巴细胞数的分析同样显示了小剂量siRNA在干扰病毒复制上的优势,白细胞数,淋巴细胞数均接近正常值。通过石蜡切片观察可知,阳性对照组在肾脏、肝脏、脾脏等器官都出现淋巴细胞增生灶,胸腺、法氏囊髓质细胞流失。预防组仅在部分器官有少许淋巴细胞浸润。通过体内外实验的检测,证明以ALV-J TM为靶蛋白,以RNAi的方式抑制病毒复制是非常有效的抗病毒方式。本实验的完成不仅为逆转录病毒的防治提供了新的途径,也为其它病毒病的治疗提供借鉴。

全文目录

英文缩略表  7-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-32
  1.1 禽白血病病毒研究现状  13-21
    1.1.1 J 亚群禽白血病  13-14
    1.1.2 ALV-J 的分子病毒学特性  14-16
    1.1.3 ALV-J 的致病性  16-17
    1.1.4 禽白血病引起的免疫抑制  17-18
    1.1.5 ALV-J 流行病学  18
    1.1.6 ALV-J 的病理变化  18-19
    1.1.7 诊断  19-20
    1.1.8 ALV-J 的防制  20-21
  1.2 RNA 干扰的研究进展  21-29
    1.2.1 RNAi 的发现及发展  21-22
    1.2.2 RNAi 的作用机制  22-23
    1.2.3 siRNA 设计  23-24
    1.2.4 siRNA 的制备  24-26
    1.2.5 体外输送  26
    1.2.6 RNAi 在动物病毒性疾病中的研究  26-29
    1.2.7 RNAi 技术的展望与未来  29
  1.3 流式细胞术  29-31
    1.3.1 流式细胞仪的基本结构和工作原理  30
    1.3.2 流式细胞术在临床上的应用  30-31
  1.4 T 淋巴细胞亚群  31-32
实验一 siRNA干扰ALV-J复制的体外研究  32-41
  摘要  32-33
  1 材料与方法  33-35
    1.1 材料来源及试剂  33
      1.1.1 试验材料  33
      1.1.2 试验地点  33
    1.2 方法及检测指标  33-35
      1.2.1 siRNA 的合成  33-34
      1.2.2 鸡胚成纤维细胞的制备  34
      1.2.3 荧光显微镜观察转染效率  34-35
      1.2.4 间接免疫荧光检测病毒感染状况  35
  2 结果与分析  35-37
    2.1 RNA 体外干扰ALV-J 复制  35-37
      2.2.1 pEGFP- gp37 融合表达载体转染 CEF  35-36
      2.2.2 siRNA 体外干扰gp37 基因  36
      2.2.3 siRNA 体外干扰ALV-J 复制  36-37
  3 讨论  37-40
  4 小结  40-41
实验二 siRNA干扰ALV-J复制的体内研究  41-58
  摘要  41-42
  1 材料与方法  42-45
    1.1 材料  42
      1.1.1 试验材料  42
      1.1.2 试验地点  42
    1.2 试验方法及检测指标  42-45
      1.2.1 实验动物感染及饲养  42-43
      1.2.2 血液学指标检测  43
      1.2.3 体重、免疫指标测定  43-44
      1.2.4 病理学变化  44-45
      1.2.5 病原学检测  45
  2 结果与分析  45-55
    2.1 临床症状  45-46
    2.2 增重、免疫指标  46-51
      2.2.1 体重  46-47
      2.2.2 免疫器官重量  47-50
      2.2.3 流式细胞仪检测 CD4+、CD8+T 淋巴  50-51
    2.3 血液学指标检测  51-52
      2.3.1 ELISA 检测血清中抗体  51
      2.3.2 白细胞数  51-52
    2.4 病理学观察  52-54
      2.4.1 大体病变  52-54
      2.4.2 组织学病变  54
    2.5 病原学检测  54-55
      2.5.1 PCR 检测结果  54-55
      2.5.2 禽白血病抗原ELISA 检测  55
  3 讨论  55-57
  4 小结  57-58
结论  58-59
参考文献  59-66
附图  66-68
致谢  68-69
攻读学位期间发表的论文  69

RNA干扰J亚群禽白血病病毒跨膜蛋白（TM）表达对病毒复制的影响

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