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牛轮状病毒(Brovine Rotavirus,BRV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员。是引起犊牛腹泻的主要病原之一。本实验利用牛轮状病毒VP6基因513~916间高保守区域设计引物,从感染牛轮状病毒细胞培养物和粪便样品提取核酸,扩增到大小400bp左右的片段,经测序证明为轮状病毒VP6片段,对扩增的敏感性测定表明,细胞培养物病毒含量在10-3 TCID50时,PCR扩增仍为阳性反应,该反应亦能扩增猪轮状病毒的VP6基因片段,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均不出现反应。说明本实验建立的PCR方法对A群轮状病毒的扩增具有高度特异性。对扩增的退火温度测定表明,温度范围在40℃~60℃对扩增产物均没有影响。这些实验结果均说明这对引物作为诊断引物具有一定的应用价值。以牛轮状病毒NCDV标准株扩增获得了VP6全基因序列,将其定向插入表达载体,通过诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,证明了约52kDa的目的蛋白表达。通过包涵体提取,Ni亲和层析,获得了纯化的重组牛轮状病毒VP6蛋白。对纯化蛋白进一步进行Western blot分析表明,该蛋白可与全病毒抗血清发生特异性反应,为以该蛋白作为检测抗原代替牛轮状病毒全病毒抗原,避免培养病毒、纯化病毒等繁琐工艺,为抗原制备提供了廉价的方法。以牛轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原,初步建立了间接ELISA进行血清抗体的检测。本实验重点对影响ELISA检测的抗原包被量、包被条件和封闭液种类进行了探索。采用矩阵法,通过对抗原包被浓度、包被稀释液和不同包被条件效果的比对,最终确定了用PH8.6磷酸盐将纯化的VP6重组蛋白稀释为0.25μg/mL加入到反应孔中,包被工作在37℃2.0h或4℃包被过夜。为降低ELISA反应的非特异性,本试验对多种封闭试剂或封闭剂联合使用进行了封闭效果对比试验,从封闭效果看,4% PEG20000作为封闭液,37℃封闭2h时效果最佳。通过条件探索,初步建立的间接ELISA方法检测牛轮状病毒血清抗体的最佳工作条件: pH8.6磷酸盐缓冲液稀包被VP6蛋白,浓度为0.25μg/mL,200μl/孔,在37℃包被2.0h或在4℃包被过夜;250μl/孔,PBST洗涤3次,每次3分钟;每孔加入200μl 4% PEG20000作为封闭液,37℃封闭2.0h,同样方法洗涤3次;加入1:100封闭液稀释的被检血清,100μl/孔,37℃作用1h,洗涤3次;加入封闭液稀释二抗,100μl/孔,37℃作用1h,洗涤3次;最后DAB-H2O2底物显色,100μl/孔,室温避光显色10~15min,加入2mol/L H2SO4,50μl/孔终止反应,用自动酶标测定仪在波长492nm处测定每孔的光吸收(OD492nm)值。
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