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血管内皮生长因子B融合蛋白的表达和纯化研究

作　者: 林子裕
导　师: 吴德峰；庞海
学　校: 福建农林大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 基因克隆重组质粒构建蛋白表达纯化结晶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景与目的:VEGF-B作为一个重要的细胞内皮生长因子,具有多种重要的生理功能。本研究通过克隆人VEGF-B cDNA来构建原核表达载体,并进行高效表达和纯化,利用基因工程技术来生产重组蛋白。材料与方法:根据GenBank中人VEGF-B成熟态的cDNA序列,结合表达载体pET-28a的特点设计、合成一对特异性引物。采用PCR的方法扩增人成熟VEGF-B蛋白cDNA片段,然后将其定向克隆到载体pET-28a中,构建原核表达重组载体pET-28a-VEGF-B;重组载体转入大肠杆菌DH5α扩增、提取后,用PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测定等方法进行鉴定。鉴定正确的阳性pET-28a-VEGF-B重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过K+抗性筛选获得稳定表达的阳性工程菌;以IPTG诱导工程菌高效表达重组蛋白VEGF-B,利用His-tag亲合层析、琼脂糖凝胶层析对重组VEGF-B蛋白进行分离纯化。结果:1、成功的构建了VEGF-B cDNA原核表达载体pET-28a-VEGF-B;建立了稳定转化pET-28a-VEGF-B重组质粒的大肠杆菌细胞株BL21-pET-28a-VEGF-B,并使VEGF-B cDNA在转化细胞内获得高效稳定表达。2、确立了工程菌以可溶性形式高效表达重组VEGF-B蛋白的培养条件,建立了高效纯化重组VEGF-B蛋白的工艺,较好地纯化出了VEGF-B蛋白,为以后进行更加深入的研究准备了基本条件。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
英文缩略表  11-12
第一部分综述  12-22
  1 血管内皮细胞生长因子（VEGF）的研究进展  12-16
    1.1 VEGF 的分子结构  12
    1.2 VEGF 家族与VEGF 的受体(VEGFR)  12-15
      1.2.1 VEGF 家族成员  12-14
      1.2.2 VEGF 的受体(VEGFR)  14-15
    1.3 VEGF 基因表达及其调控因素  15-16
      1.3.1 缺氧和缺血  15
      1.3.2 细胞因子  15-16
      1.3.3 其它因素  16
  2 VEGF 的生物学功能及其相关应用  16-19
    2.1 VEGF 生物学功能  16-17
    2.2 VEGF 的相关应用  17-19
  3 血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)研究进展  19-21
    3.1 结构特征  19-20
    3.2 功能特点  20
    3.3 不同组织中的表达  20
    3.4 VEGF-B 与动物医学的关系及本实验的研究应用意义  20-21
  4 血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)研究的意义  21-22
第二部分 PET-28A-VEGF-B 的原核表达载体的构建及鉴定  22-39
  1 材料与方法  22-32
    1.1 材料  22-24
      1.1.1 模板与载体  22
      1.1.2 工程菌  22
      1.1.3 酶及主要试剂  22-23
      1.1.4 仪器设备  23-24
    1.2 方法  24-32
      1.2.1 化学合成基因片段与引物设计  24-25
      1.2.2 VEGF-B 基因的常规PCR 扩增与检测  25-26
      1.2.3 PCR 扩增产物的回收与纯化  26-27
      1.2.4 SDS 碱裂解法提取PET-28A 载体质粒  27-28
      1.2.5 PCR 产物与PET-28A 载体的双酶切产物回收  28
      1.2.6 回收产物的连接与转化方法  28-30
      1.2.7 重组质粒的筛选鉴定  30-31
      1.2.8 基因序列的测定分析  31-32
  2 结果与分析  32-35
    2.1 目的基因的常规PCR 扩增结果  32-33
    2.2 琼脂糖凝胶提取PET-28A 质粒的检测结果  33
    2.3 PET-28A-VEGF-B 重组质粒的鉴定结果  33-34
    2.4 序列鉴定  34-35
  3 实验讨论  35-39
    3.1 PCR 扩增目的基因的特异性  35-36
      3.1.1 引物设计的一般要求  35
      3.1.2 引物使用及保存  35
      3.1.3 引物的另一个重要参数是熔解温度（TM）  35-36
      3.1.4 热启动PCR (HOT START PCR)  36
      3.1.5 确定循环数的基本原理  36
    3.2 目的基因VEGF-B 的制备  36-37
    3.3 PET-28A-VEGF-B 表达重组体的构建和鉴定  37-39
第三部分 PET-28A-VEGF-B 在大肠杆菌中的表达与纯化  39-52
  1 材料  39-42
    1.1 主要试剂及溶液  39-41
    1.2 实验仪器  41-42
    1.3 菌株与重组质粒  42
  2 实验方法  42-44
    2.1 重组质粒PET-28A-VEGF-B 转化BL21(DE3)  42
    2.2 转化子的试表达及保存  42
    2.3 SDS-PAGE 电泳操作步骤  42-43
    2.4 工程菌PET-28A-VEGF-B/BL21(DE3)表达条件的优化  43-44
      2.4.1 最佳诱导温度的确定  43
      2.4.2 最佳IPTG 诱导浓度的确定  43
      2.4.3 最佳IPTG 诱导时间的确定  43-44
      2.4.4 重组蛋白表达形式的确定  44
  3 结果与分析  44-48
    3.1 重组工程菌在BL21 中的试表达结果  44-45
    3.2 重组蛋白PET-28A-VEGF-B 表达形式鉴定结果  45-46
    3.3 PET-28A-VEGF-B 在BL21(DE3)中蛋白的诱导表达条件的优化  46-47
      3.3.1 重组工程菌培养最佳温度的确定  46
      3.3.2 IPTG 诱导时间的确定  46
      3.3.3 IPTG 诱导剂量的确定  46-47
    3.4 重组融合蛋白PET-28A-VEGF-B 的HIS-TAG 亲和层析纯化结果与分析  47-48
  4 讨论  48-52
    4.1 重组蛋白纯化的总体策略  48-49
    4.2 蛋白纯度、得率及对目标蛋白的要求  49
    4.3 如何保持所纯化重组蛋白质的生物学活性  49-50
    4.4 如何保证蛋白质纯化的有效性  50
    4.5 分离纯化的基本原则  50-51
    4.6 可溶重组蛋白的分离纯化  51-52
全文总结  52-54
参考文献  54-59
致谢  59

血管内皮生长因子B融合蛋白的表达和纯化研究

内容摘要

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