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猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株的分离鉴定及其全基因组分子特征分析

作　者: 郝雪峰
导　师: 罗建勋；殷宏
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分离鉴定 全基因组 序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本研究用Marc-145细胞从湖南宁乡县疑似猪繁殖与呼吸综合征病猪采集的病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,命名为HN-HW株。采用RT-PCR、FA和免疫电镜方法对该毒株进行了鉴定,并在Marc-145细胞上增殖和测定了TCID50。采用5’Full RACE、3’FullRACE及RT-PCR技术,分段设计引物扩增并克隆了此毒株的所有cDNA片段,测序后经序列拼接获得该病毒的全基因组序列,序列分析结果表明,此毒株为美洲型PRRSV;进一步利用GenBank中国内外其它分离株的已知序列进行分析和比较,对该分离株基因组分子特征进行了初步描述。1.将采集到的肺脏、肝脏、肾脏等病料经过研磨、过滤等处理后,接种于生长良好的单层Marc-145细胞上,细胞于接种72 h后出现明显的细胞聚集成丛,随后固缩、变圆、脱落等细胞病变,并通过RT-PCR方法确定了病毒在Marc-145细胞上的增殖。利用免疫荧光抗体技术在接毒细胞的细胞浆中观察到了特异性的免疫荧光。电镜观察其超微结构可见大小为50 nm-60 nm的病毒粒子。测定此分离毒株第五代细胞毒滴度为10-5.76TCID50/mL。2.采用5’Full RACE、3’Full RACE技术及RT-PCR方法,分段设计引物,成功扩增出PRRSVHN-HW株的全基因组cDNA片段,分别将其克隆到pGEM-Teasy载体中,对鉴定为阳性的重组质粒进行测序,经序列拼接获得此毒株全基因序列。3.序列比较结果显示表明,HN-HW株与国内外各美洲型分离株全序列的同源性在85.3%～99.4%之间,而与欧洲型分离株LV的差异较大,同源性仅为59.7%。表明HN-HW株为美洲型毒株。以美洲型标准毒株ATCC VR-2332的NSP2氨基酸序列为参照,HN-HW株在Nsp2区域缺失了30个氨基酸,缺失氨基酸分别位于481位和第532～560位。依据全基因组核苷酸序列进行了系统进化分析,结果表明HN-HW株与JXA1、HEB-1、HUB-1和HUB-2的遗传关系最近,属于一个新的分支;而SP、Prime Pac、VR-2332、BJ-4、MN184A等毒株则分属于美洲型其它的分支。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章 绪论  11-22
  1.1 病原学  11-13
    1.1.1 PRRSV起源  11-12
    1.1.2 PRRSV基本特征  12-13
    1.1.3 PRRSV遗传变异  13
    1.1.4 PRRSV生物学特性  13
  1.2 基因组与蛋白质组学特征  13-15
    1.2.1 基因组概况  13-14
    1.2.2 病毒蛋白质  14-15
  1.3 致病机制与病理组织学变化  15-16
    1.3.1 发病机制  15-16
    1.3.2 病理组织学变化  16
  1.4 流行病学  16-17
  1.5 诊断检测技术  17-19
    1.5.1 临床诊断  17-18
    1.5.2 实验室诊断  18-19
    1.5.3 针对高致病性蓝耳病的诊断方法  19
  1.6 防治技术  19-21
    1.6.1 灭活疫苗  20
    1.6.2 弱毒疫苗  20
    1.6.3 基因工程疫苗  20-21
  1.7 本研究的目的和意义  21-22
第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株的分离与鉴定  22-37
  2.1 材料与方法  22-28
    2.1.1 材料  22-23
    2.1.2 方法  23-28
  2.2 结果  28-35
    2.2.1 疑似病料的RT-PCR检测及核苷酸序列测定  28-29
    2.2.2 细胞传代分离病毒结果  29-30
    2.2.3 细胞毒RT-PCR检测结果  30
    2.2.4 病毒TCID_50的测定结果  30-31
    2.2.5 病毒荧光抗体鉴定  31-32
    2.2.6 细胞培养液中病毒粒子的电镜观察结果  32-33
    2.2.7 NSP2部分基因序列分析  33-35
  2.3 讨论  35-36
    2.3.1 PRRSV HN-HW株的分离和初步鉴定  35
    2.3.2 病毒分离过程中的显著特点  35-36
  2.4 小结  36-37
第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因测定  37-49
  3.1 材料与方法  37-45
    3.1.1 材料  37-38
    3.1.2 方法  38-45
  3.2 结果  45-47
    3.2.1 PRRSV HN-HW株各个基因片段的RT-PCR扩增结果  45-47
    3.2.2 PRRSV HN-HW株全基因组序列结果  47
  3.3 讨论  47-48
  3.4 小结  48-49
第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析  49-72
  4.1 材料与方法  49-50
    4.1.1 材料  49
    4.1.2 方法  49-50
  4.2 结果  50-69
    4.2.1 PRRSV HN-HW株的基因组成和结构分析  50-51
    4.2.2 PRRSV HN-HW株各读码框及非编码区核苷酸序列同源性分析  51-52
    4.2.3 PRRSV HN-HW株5'非编码区(5'UTR)核苷酸序列分析  52
    4.2.4 PRRSV HN-HW株3'非编码区(3'UTR)核苷酸序列分析  52
    4.2.5 PRRSV HN-HW株各编码蛋白推导氨基酸序列分析  52
    4.2.6 PRRSV HN-HW株非结构蛋白基因组成与同源性分析  52-53
    4.2.7 PRRSV HN-HW株全长序列的系统进化分析  53-69
  4.3 讨论  69-71
    4.3.1 PRRSV的变异  69-70
    4.3.2 5'UTR及3'UTR的变异  70
    4.3.3 非结构蛋白编码区的变异  70
    4.3.4 结构蛋白编码区的变异  70-71
    4.3.5 PRRSV HN-HW株的系统进化分析  71
  4.4 小结  71-72
第五章 全文结论  72-73
参考文献  73-82
致谢  82-83
附录  83-101
作者简历  101

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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