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几种哺乳动物胚胎干细胞建系与初步鉴定
作 者: 张慧
导 师: 况玲
学 校: 新疆农业大学
专 业: 临床兽医学
关键词: 小鼠胚胎干细胞 大鼠胚胎干细胞 兔胚胎干细胞 牛胚胎干细胞 建系 悬浮培养 AKP染色 畸胎瘤
分类号: Q813.11
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是一种将着床前胚胎的内细胞团(inner cell mass, ICM)在体外培养而成的细胞,目前,仅小鼠和大鼠ES细胞系能在嵌合体中进入生殖嵴并形成生殖细胞,而其他哺乳动物,都没有建立能形成生殖细胞的ES细胞系。我们运用全新的培养体系对兔、大鼠和牛ES细胞进行建系研究,以及研究小鼠ES细胞的悬浮培养体系,建立了兔、大鼠、牛和小鼠胚胎干细胞系,并经过长期培养仍保持发育的多能性。将兔、大鼠和牛的囊胚在体外机械法分离ICM,在各自的培养体系中培养,用机械法传代,将兔ES细胞培养到4代,将大鼠和牛ES细胞培养到10代和7代,均保持典型的ES细胞形态,经碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色为阳性;R1系mES细胞在培养液A中能够快速增殖,AKP染色呈阳性,并保持未分化状态而传20代以上,注射到nod-scid小鼠后腿肌肉,成功长出畸胎瘤。因此得出:兔ES细胞在灭活的胎鼠内胚层细胞作饲养层,78%D-MEM/F-12+20% KnockoutSR+ 2mM/L-Glutamine+1% MEM NAA+0.1 mM/Lβ-mercaptoethanol+8 ng/ml hrbFGF+2%CEE作培养基所构成的体系中,能很好的被分离培养,小鼠内胚层细胞和CEE联合使用能很好的支持原代兔ES细胞的生长。同样以86% DMEM + 10% SR + 3% CEE + 1% MEM NAA + 2 mmol/L L-Glutamine + 0.1 mmol/Lβ-mercaptoethanol为培养基,大鼠ES细胞在灭活的3T3细胞作饲养层的体系中,保持未分化状态传到10代以上;而牛ES细胞在原饲养层,保持未分化状态到7代左右。在15% FBS + 1000IU mLIF + 0.2mg/ml dispase + 84% DMEM/F12 + 1% MEM NAA + 2 mmol/L L-Glutamine+ 0.1 m mol/Lβ-mercaptoethanol培养基中悬浮培养小鼠ES细胞可在体外维持不分化状态,能够快速增殖。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-7 第一章 胚胎干细胞国内外研究进展及分析 7-20 1.1 胚胎干细胞建系研究现状 8 1.2 兔、牛和大鼠的胚胎干细胞建系的国内外研究进展 8-15 1.3 其他几种哺乳动物建系的国内外研究进展 15-17 1.4 ES细胞悬浮培养 17-20 第二章 兔胚胎干细胞早期培养条件研究 20-27 2.1 材料与方法 20-23 2.2 结果 23-24 2.3 讨论 24-27 第三章 大鼠和牛胚胎干细胞的建系及鉴定 27-38 3.1 材料和方法 27-30 3.2 结果 30-34 3.3 讨论 34-38 第四章 小鼠胚胎干细胞的悬浮培养 38-44 4.1 材料与方法 38-39 4.2 结果 39-41 4.3 讨论 41-44 结论 44-45 参考文献 45-52 致谢 52-53 作者简介 53
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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学(生物技术) > 细胞工程 > 细胞、组织培养技术 > 细胞培养
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