学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

异补骨脂甲素促小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞及相关机制研究

作　者: 王丹音
导　师: 楼宜嘉
学　校: 浙江大学
专　业: 药理学
关键词: 小鼠胚胎干细胞神经分化异补骨酯甲素蛋白异戊烯化 ERK 异补骨脂甲素 Junctophilin-3,Junctophilin-4
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 9次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的：探索异戊烯基黄酮异补骨脂甲素(Isobavachin, IBA)是否具有促小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)细胞定向分化为神经细胞的作用,并探索其相应的分化机制。方法：采用悬滴培养4-/4+法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体,继而进行贴壁培养。IBA以终浓度为10-7mol/L诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,10-7mol/L全反式维甲酸(Retinoic acid, RA)为阳性对照,0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。在分化培养终点,利用光镜和免疫荧光成像法鉴定神经元形成(轴突长度是胞体长度的3倍及以上)。收集ES细胞、拟胚体(embryoid bodies, EBs)、铺展培养d 8+0、d 8+5、d 8+10各时期细胞样本,用Western-blot以及RT-PCR法,评价神经细胞微管蛋白(β-tubulinⅢ)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP),作为ES细胞定向分化为神经细胞的指标；观察巢蛋白基因(nestin),神经纤维蛋白(NEFM),干细胞未分化状态基因(OCT3/4)等在各个神经分化时期表达特征。同时利用、Vestern-blot (?)去检测MAPK通路中p38, ERK, JNK磷酸化等相关分子事件的变化,以探索神经分化的可能机制。添加IBA时同步添加异戊稀基酶Ⅰ型抑制剂GGTI-298,通过条件摸索确定终浓度为10-6mol/L,观察其是否对IBA的促神经分化作用有影响,验证蛋白异戊稀化是否与IBA促小鼠ES细胞定向分化为神经细胞呈相关性。结果：IBA诱导ES细胞分化为神经细胞过程中,光镜下多数呈典型神经元表型,即轴突长度是胞体长度的3倍及以上。免疫荧光成像结果表明,EBs期呈nestin,OCT3/4阳性表达；分化后期大多数呈神经元表型,并分别表达β-tubulinⅢ, ChAT,GABA等阳染,少量未呈神经元表型者GFAP阳染。Western blot (?)去观察在分化过程中,β-tubulinⅢ, GFAP表达均随分化时程延长而呈上调趋势,尤以β-tubulinⅢ阳性表达为甚。同步添加异戊稀基酶抑制剂GGTI-298能显著减少IBA促ES细胞分化为神经细胞,而未明显影响RA促神经细胞分化,提示两种化合物诱导神经分化作用机制不尽相同。MAPK通路中p38和JNK的磷酸化表达下调,ERK磷酸化表达上调,提示该通路不同蛋白的磷酸化与否与IBA诱导ES细胞分化为神经细胞呈相关性。结论：IBA具有促进小鼠ES细胞定向分化为神经细胞的作用,主要为神经元,并有一定比例的星形胶质细胞,异戊稀基是IBA促神经分化的功能基团。IBA通过蛋白异戊烯化,下调MAPK通路中p38,JNK磷酸化,上调ERK磷酸化促进小鼠ES细胞定向分化为神经细胞。目的：探索异补骨脂甲素(Isobavachin, IBA)促小鼠ES细胞神经元分化过程中是否伴随可兴奋细胞运动记忆相关蛋白Junctophilin 3,4(JP-3和JP-4)的表达。方法：采用悬滴培养4-/4+法模拟体内胚胎发育状态,形成拟胚体(embryoid bodies, EBs),继而进行贴壁培养。IBA以终浓度为10-7mol/L诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,10-7mol/L全反式维甲酸(Retinoic acid, RA)为阳性对照,0.1%二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照。在分化培养终点,利用光镜和免疫荧光成像法鉴定神经元,JP-3和JP-4的表达。收集ES、EBs、铺展培养d 8+0、d 8+5、d 8+10各时期细胞样本,用Western-blot法,评价神经细胞微管蛋白(β-tubulinⅢ)和运动记忆相关蛋白(JP-3和JP-4)的表达与叠加特征,作为ES细胞定向分化为可兴奋性神经细胞的指标。观察巢蛋白基因(nestin),干细胞多潜能基因(OCT3/4)等随着神经分化的变化特征。结果：IBA诱导ES细胞分化为神经细胞过程中,免疫荧光成像表明,高度表达nestin的EBs同时高度表达JP-3和JP-4;随着神经分化时程,JP-3和JP-4逐步减少,分化末期d 8+10,DMSO组几乎无JP-3和JP-4表达,RA和IBA组尚有少量蛋白表达。JP-3和JP-4多数表达于神经元胞体中,鲜有出现在轴突及突触中。结论：IBA促小鼠ES细胞分化的神经元具有表达运动记忆相关蛋白的功能。JP-3和JP-4在神经分化早期高度表达,成熟神经元表达量相对减少,且分布存在一定的区域性。

全文目录

致谢  4-6
本课题受以下基金资助  6-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
中英文/缩写词对照表  13-17
第一章异补骨脂甲素促小鼠胚胎干细胞分化为神经元及星形胶质细胞  17-43
  引言  17-20
  1.1 实验仪器与材料  20-21
  1.2 实验方法  21-26
    1.2.1 ES细胞常规培养  21-22
      1.2.1.1 原代小鼠胚胎成纤维细胞制备  21-22
      1.2.1.2 饲养层细胞制备  22
      1.2.1.3 ES细胞支持培养  22
    1.2.2 小鼠ES细胞体外定向分化为神经细胞培养  22-23
    1.2.3 光镜评价细胞表型  23
    1.2.4 免疫细胞化学法  23
    1.2.5 Western-blot检测蛋白表达  23-24
    1.2.6 RT-PCR法检测基因表达  24-26
  1.3 实验结果  26-39
    1.3.1 小鼠ES细胞定向分化神经细胞表型特征  26-27
    1.3.2 光镜下观察小鼠ES细胞分化的神经细胞  27-28
    1.3.3 免疫荧光鉴定分化的神经细胞亚型评价  28-29
    1.3.4 IBA促小鼠ES分化乙酰胆碱和γ-氨基丁酸功能形成  29-31
    1.3.5 IBA诱导ES分化为神经细胞过程中的生物信息和分化机制研究  31-39
      1.3.5.1 分化过程中发育依赖性基因以及标志性神经基因的表达变化  31-32
      1.3.5.2 IBA诱导ES分化为神经细胞过程中神经特异性蛋白表达的变化  32-34
      1.3.5.3 GGTase Ⅰ抑制剂GGTI-298对IBA促神经分化的影响  34-37
      1.3.5.4 分化过程中MAPK通路蛋白表达的变化  37-39
  1.4 讨论  39-42
  1.5 小结  42-43
第二章异补骨脂甲素促小鼠ES细胞分化为神经元伴随JP-3,JP-4蛋白表达  43-50
  前言  43-44
  2.1 实验材料  44
  2.2 实验方法  44
  2.3 实验结果  44-47
    2.3.1 EB期的形态学观察  44-45
    2.3.2 免疫荧光检测神经细胞中JP-3,JP-4蛋白表达情况  45-46
    2.3.3 Western blot检测神经细胞中JP-3、JP-4蛋白表达的变化  46-47
  2.4 讨论  47-49
  2.5 小结  49-50
论文创新点  50-51
参考文献  51-54
综述小分子化合物在胚胎干细胞中的研究现状  54-67
  参考文献  63-67
作者简历及在读期间所取得的科研成果  67-68

异补骨脂甲素促小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞及相关机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文