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解决人胚胎干细胞免疫排斥的方法研究

作　者: 欧阳琦
导　师: 卢光琇
学　校: 中南大学
专　业: 干细胞工程学
关键词: 人胚胎干细胞干细胞工程免疫排斥细胞分化正常二倍体核型孤雌胚胎囊胚培养全基因组孤雌激活干细胞移植分化能力特性鉴定 pluripotent 原核的细胞库纯合配型特异性建系细胞类型
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)是从囊胚内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)分离得到,能够在体外无限增殖并且保持核型稳定,在特定的诱导条件下还可以向三个胚层的任何细胞类型分化。因此,hESCs不仅是研究人类胚胎发育的最佳模型,也是未来再生医学应用上极富前景的种子细胞来源。但是hESCs及其分化后的功能细胞表达主要组织相容性抗原(Major Histocompatibility Complex, MHC),移植到宿主体内后可能因MHC不相容而刺激机体引起免疫排斥反应,导致移植治疗失败,这将成为hESCs未来临床应用的主要挑战之一。因此,要实现hESCs及其功能产物安全应用的关键之一就是如何解决免疫排斥问题。本研究主要从两个方面探讨克服干细胞移植的免疫排斥障碍的策略：建立胚胎干细胞库进行MHC配型；建立孤雌胚胎干细胞系,一方面更容易得到HLA纯合的胚胎干细胞系从而提高干细胞库的MHC配型效率,另一方面也是女性患者自身特异性的多能性干细胞。全文共包括2个部分,分述如下：第一章中国人类胚胎干细胞库的建立以及HLA配型分析目的：探讨能否利用质差或者异常受精的胚胎建立胚胎干细胞库,以及建立的胚胎干细胞库用于干细胞移植时HLA匹配的可行性。方法：利用体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗中的废弃胚胎建立人类胚胎干细胞库,包括：异常原核的胚胎、受精后第三天观察质量较差的胚胎、植入前遗传学诊断异常(PGD)的胚胎。对建立的胚胎干细胞系进行细致全面的特性鉴定以及HLA和ABO基因分型检测。然后与中华骨髓库湖南分库中随机选择的5236名正常人群进行HLA匹配分析。结果：共采用692枚囊胚,建立了188个hESCs系,这些细胞系均具有胚胎干细胞的典型特征,其中153(81.4%)株具有正常二倍体核型。具有二倍体HLA基因型的174株hESCs系与5236名假想患者进行了HLA配型分析,结果表明：这些hESCs系能够为24.94%-56.26%的假想患者提供良好的HLA匹配,并且匹配率的高低与民族差异无关。此外,8个HLA纯合型hESCs系贡献了细胞库不同HLA匹配水平上50-80%的匹配效率。结论：利用临床废弃胚胎能够建立人胚胎干细胞库,并且能够具有较大的HLA配型价值,为解决干细胞移植的免疫排斥问题提供了一个良好的策略。第二章孤雌胚胎干细胞的建立以及与正常胚胎干细胞生物学特性的比较研究目的：通过孤雌激活的方法建立患者特异性胚胎干细胞系,并与正常受精来源的胚胎干细胞进行生物学特性的比较研究,探讨孤雌胚胎干细胞是否与正常受精胚胎干细胞一样具有巨大的临床应用前景。方法：利用人工孤雌激活的胚胎以及IVF-ET过程中自然孤雌激活的1PN胚胎建立孤雌胚胎干细胞(Parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)系,对pESCs系进行细致全面的干细胞特性鉴定。并从三个方面对pESCs系与正常受精hESCs系进行比较研究,包括：印记基因的表达、全基因组范围内基因表达差异的分析、全基因组SNP的分布特点以及三个胚层主要器官发育关键基因的表达对比分析。结果：pESCs仅表达母源性印记基因,父源性印记基因沉默,而正常受精hESCs同时表达父源和母源印记基因。在全基因组SNP分布方面,自然激活孤雌胚胎来源的chHES-32表现为绝大多数位点纯合,人工激活孤雌胚胎来源的chHES-69表现为大片段的纯合与杂合并存,而正常受精胚胎的chHES-8和chHES-10表现为绝大多数位点杂合。将pESCs和正常hESCs制备EB,体外自发分化21天后,通过RT-PCR以及Real-time PCR检测三胚层主要器官发育关键基因的表达,发现pESCs没有明显的分化缺陷。基因芯片聚类分析发现,pESCs与正常hESCs之间没有明显差异。结论：pESCs在培养过程中能够保持母源性印记基因的表达特点,不同孤雌激活方法得到的pESCs与正常受精hESCs在全基因组SNP的分布上存在明显差别,pESCs没有明显的分化能力障碍。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-12
前言  12-14
第一章中国人类胚胎干细胞库的建立以及HLA配型分析  14-40
  1. 材料与方法  15-21
    1.1 研究材料  15-16
    1.2 实验方法  16-21
  2 结果  21-30
    2.1 利用质差或者异常胚胎建立人类胚胎干细胞的情况  21-24
    2.2 在hEFs饲养层上生长的hESCs的特征鉴定  24-25
    2.3 174个hESCs的MHC表达特点  25
    2.4 174个hESCs与湖南人群MHC分布的比较  25-27
    2.5 hESCs与湖南假定患病人群MHC匹配率的分析结果  27-28
    2.6 HLA纯合型hESCs系的SNP分析以及对于HLA匹配效率的影响  28-29
    2.7 HLA匹配效率与民族之间的关系  29-30
  3 讨论  30-35
  4 图表与说明  35-40
第二章孤雌胚胎干细胞的建立以及与正常胚胎干细胞生物学特性的比较研究  40-59
  1 材料与方法  42-46
    1.1 研究材料  42-43
    1.2 研究方法  43-46
  2 结果  46-49
    2.1 卵细胞孤雌激活的效率  46-47
    2.2 孤雌胚胎干细胞系的分离与干细胞特征性鉴定  47
    2.3 印记基因的表达分析  47-48
    2.4 体外分化能力的比较  48
    2.5 pESCs与正常受精hESCs之间基因组聚类分析  48-49
  3 讨论  49-52
  4 图表与说明  52-59
总结  59-60
参考文献  60-65
综述克服人胚胎干细胞免疫原性的新策略及研究进展  65-76
附录一:188株hESCs系的鉴定结果列表  76-83
附录二:人胚胎干细胞系chHES-8——chHES-195的DNA指纹数据  83-90
附录三:174个hESCs系的MHC分型结果  90-96
攻读学位期间主要的研究成果目录  96-97
致谢  97

解决人胚胎干细胞免疫排斥的方法研究

内容摘要

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