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豫产道地中药材金银花离体培养技术研究

作　者: 刘文英
导　师: 李明军
学　校: 河南师范大学
专　业: 植物学
关键词: 金银花快繁愈伤组织细胞悬浮培养生长曲线生理生化变化
分类号: S567.79
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

金银花（Lonicera japonica Thunb.）是忍冬科忍冬属多年生木质藤本,其干燥花蕾和初开的花是临床上常用的药物,主要药用成分是绿原酸和异绿原酸,具有抑菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、解热、保肝、止血、降脂、抗生育、抗氧化、免疫调节等多种功效。主产于河南省封丘县的金银花是我国著名的道地中药材,但在生产中,其品种单一、退化严重且繁殖速度较慢,无法满足大田规模化种植和市场的需求。针对以上问题,我们首次对金银花中的优良品种“金丰一号”的离体培养进行了系统的研究。取得了如下研究成果:1.建立了无菌培养技术体系。将金银花顶芽剥离成两叶一心后,在75 %酒精中灭菌30 s,再用0.1 %升汞处理15 min,然后无菌水冲洗5-6次,无菌苗得率达78.90 %,接种于MS+6-BA 1.0 mg·L^-1 +NAA 0.2 mg·L^-1培养基上进行培养,30 d即可获得无菌试管苗。2.建立了快繁技术体系。适于试管苗快繁的培养基是MS+6-BA 0.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+生物素-D 2 mg·L^-1,繁殖周期为28 d,繁殖系数达到7.37;适于生根的培养基为1/2MS+IBA3 mg·L^-1+0.2 g·L^-1活性炭+15 g·L^-1蔗糖,配以合适的栽后管理,移栽成活率达100 %。3.探讨了愈伤组织诱导与继代的最佳条件。最佳外植体是花蕾,其次是叶片,最佳培养基是MS+NAA 2 mg·L^-1+6-BA 0.01 mg·L^-1+2,4-D 0.5 mg·L^-1,诱导率达100 %;适宜的继代培养基是MS+6-BA 2 mg·L^-1+KT 0.75 mg·L^-1+NAA 0.25 mg·L^-1,在此继代培养基上,经过3-5次继代后可以得到四种不同类型的愈伤组织。4.建立了细胞悬浮培养技术体系。选择黄白色、小颗粒、结构疏松、生长迅速的愈伤组织转入MS+6-BA 1.5 mg·L^-1+KT 0.75 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1的液体培养基中,建立细胞悬浮培养体系。在该体系中细胞生长曲线呈“S”型,可分为延迟期(0^-12 d)、指数生长期(12^-18 d)和缓慢生长期（18-24 d）三个阶段,培养过程中细胞干重呈现上升趋势,并在18 d时达到最大,为8 g·L^-1。5.研究了细胞悬浮培养过程中生理生化变化规律。（1）可溶性糖含量在培养过程中先下降后上升,3^-18 d时,可溶性糖含量迅速上升,并于18 d时达到峰值;（2）可溶性蛋白质含量呈降升降趋势,0-6 d时缓慢下降,6-9 d时明显增长,9^-15 d时相对含量变化不大,于12 d时可溶性蛋白质含量达到峰值,比细胞生长高峰提前6 d,之后呈下降趋势;（3）POD活性大致呈先升后降的趋势,0-6 d时先升后降,3 d时是一小高峰,6^-12 d时伴随着细胞旺盛生长,开始迅速上升并在12 d时达到高峰,之后持续下降;（4）SOD活性呈先升后降的趋势,0-9 d时缓慢增长,9^-12 d时迅速升高,12 d时达到峰值,之后呈持续下降趋势;（5）悬浮培养液的pH值先下降、后略微上升、再渐趋于平缓,维持在5.14-4.89之间;（6）悬浮培养液的电导率呈先缓慢上升后急剧下降再稍上升的趋势,0^-12 d时,培养液的电导率一直呈极缓慢上升趋势,在12 d时升至最高点(0.53×104μs·cm^-1),随即呈下降趋势,与细胞生长呈现一定的相关性;（7）培养周期中绿原酸含量呈升降升降的趋势,0-6 d,绿原酸呈急剧上升趋势,在第6 d时升至最高点,随即呈下降趋势,15-21 d时再次呈上升趋势,直至在第21 d时达到另一峰值,只是比第一峰值（6 d时）低,21 d之后绿原酸含量又急剧下降。6.初步研究了金银花染色体制片技术。以根尖为材料,用0.1 %的秋水仙素室温下避光预处理4 h,在1 mol·L^-1盐酸65℃恒温水浴中解离3 min,改良卡宝品红染液室温下染色4 h后,能取得良好的制片效果。本文的研究结果,为进一步通过植物生物技术进行新品种的培育、良种的离体快繁以及有效药用成分的工厂化生产奠定了技术基础。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
缩略语  9-13
1 前言  13-23
  1.1 金银花概述  13-14
  1.2 金银花研究进展  14-21
  1.3 本课题的研究内容、目的及意义  21-23
2 材料与方法  23-33
  2.1 材料  23
  2.2 方法  23-33
    2.2.1 金银花试管苗繁殖技术体系的建立  23-25
    2.2.2 试管苗的生根  25
    2.2.3 试管苗的移栽  25
    2.2.4 金银花愈伤组织的诱导和细胞悬浮培养体系的建立  25-31
    2.2.5 金银花染色体制片技术的初步研究  31
    2.2.6 数据处理与统计分析  31-33
3 结果与分析  33-57
  3.1 金银花试管苗快繁培养体系的建立  33-44
    3.1.1 无菌材料的获得  33-34
    3.1.2 试管苗初代培养基的筛选  34-36
    3.1.3 试管苗快繁培养基的筛选  36-44
  3.2 金银花愈伤组织的诱导、继代和细胞悬浮培养体系的建立  44-54
    3.2.1 愈伤组织的诱导  44-45
    3.2.2 愈伤组织的继代培养  45-48
    3.2.3 细胞悬浮培养体系的建立  48-49
    3.2.4 细胞生长特性及细胞悬浮培养过程中一些生理生化指标的研究  49-54
  3.3 金银花染色体制片技术的初步研究  54-57
    3.3.1 秋水仙素预处理时间对制片效果的影响  54-55
    3.3.2 盐酸解离时间对制片效果的影响  55
    3.3.3 卡宝染液染色时间对压片效果的影响  55-56
    3.3.4 染色体数目的观察与统计  56-57
4 讨论  57-69
  4.1 正交设计在培养基筛选中的应用  57
  4.2 金银花离体培养体系  57-61
    4.2.1 无菌材料的获得  57-58
    4.2.2 植物生长物质对试管苗快速繁殖的影响  58
    4.2.3 基本培养基对试管苗快速繁殖的影响  58-59
    4.2.4 IBA 对试管苗生根的影响  59-60
    4.2.5 基本培养基对试管苗生根的影响  60
    4.2.6 蔗糖对试管苗生根的影响  60
    4.2.7 活性炭对试管苗生根的影响  60-61
    4.2.8 试管苗的炼苗和移栽  61
  4.3 愈伤组织的诱导、继代和细胞悬浮培养体系的建立  61-62
    4.3.1 外植体对愈伤组织的诱导、继代的影响  61-62
    4.3.2 植物生长物质对愈伤组织的诱导、继代的影响  62
  4.4 细胞悬浮培养体系及培养过程中生理生化变化  62-66
    4.4.1 植物细胞生长特性  62-63
    4.4.2 可溶性糖含量变化  63
    4.4.3 可溶性蛋白质含量变化  63-64
    4.4.4 POD 活性变化  64
    4.4.5 SOD 活性变化  64-65
    4.4.6 培养液pH 值变化  65
    4.4.7 培养液电导率变化  65-66
    4.4.8 绿原酸含量变化  66
  4.5 金银花染色体制片技术的初步研究  66-69
    4.5.1 预处理时间对染色体制片效果的影响  66
    4.5.2 解离时间对染色体制片效果的影响  66-67
    4.5.3 染色时间对染色体制片效果的影响  67-69
5 结论  69-71
图版  71-75
参考文献  75-87
致谢  87-89
攻读硕士学位期间发表论文清单  89-90

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