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小鼠胚胎干细胞来源神经前体细胞的移植研究及兔脾成纤维样细胞的多功能性研究

作　者: 冯树梅
导　师: 张铭
学　校: 浙江大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 胚胎干细胞 神经前体细胞 帕金森 畸胎瘤 兔脾成纤维细胞 LIF 多向分化
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


帕金森病(Parikinson’s disease,PD)是一种严重的神经系统退行性疾病,病变主要累及中脑黑质致密部,大量多巴胺能神经元变性或进行性缺失导致纹状体内多巴胺水平降低,患者在临床上表现为静止性震颤、运动迟缓和肌强直。随着人类寿命的延长,PD发病率已明显上升,然而PD的药物治疗药效不能持久,同时有副作用的危害,因此以细胞替代为出发点的干细胞移植疗法为PD治疗提供了一个新策略。在众多候选细胞中,胚胎干细胞(ESCs)因其无限的自我更新能力和三胚层分化能力,成为PD治疗的理想细胞来源。未分化的ESCs移植研究显示,虽可引起模型动物的部分功能恢复,同时亦存在畸胎瘤的威胁。ESCs来源的神经前体细胞既具有神经细胞分化的能力,同时保留了一定的增殖特性,有可能在体内持续呈现其神经替代和保护作用。本文采用无血清、低密度快速诱导ESCs向神经前体细胞分化,短期内可得到大量可用于移植的细胞。经免疫细胞化学和RT-PCR分析表明,这些细胞为高纯度的神经前体细胞,其分化率接近100%。将所诱导细胞以10~5植入PD模型小鼠纹状体后发现,2周始纹状体内就有多巴胺能神经元(酪氨酸羟化酶阳性)出现,同时HPLC分析表明,2周时纹状体多巴胺分泌水平显著增加,与PBS移植组相比存在显著差异(P＜0.05),4周时多巴胺水平有所降低,此外4周时18.75%PD模型鼠移植部位成瘤,经组织学分析表明其中含有三胚层来源的多种细胞。以上数据说明,这种快速诱导体系可产生有一定功能的神经前体细胞,但该高纯度前体细胞仍有致瘤性,可能提示该细胞的发育学地位更加接近于ESCs,对其发育学表型的进一步探讨,将为ES来源的移植级别神经前体细胞的研究奠定基础。ESCs来源于着床前胚胎的内细胞团,其常规建系和培养都是建立在胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层和外源LIF的共同作用之下。而MEF体外传代次数有限,通常在5-7代,其次,在无外源性UF的辅助作用时,单独MEF培养不足以维持小鼠ES细胞的未分化和自我更新特征,另据最近的报道显示MEF可能携带有逆转录病毒,从而存在较大的安全隐患。为此,我们从兔脾中分离到一类成纤维样细胞(RSF),这类细胞增殖能力是MEF的2-3倍,且体外传代能力长达13代。最为突出的是这类细胞可在无外源LIF添加的情况下维持小鼠ESCs的生长,目前已支持ESCs生长超过10代,且ESCs能维持其未分化表型,如AKP、SSEA-1、REX1的表达,完整的体内外分化潜能,核型分析也表明其具有正常的二倍体核型,40XY。此外经透射电镜分析证实,我们所获得的RSF细胞未携带逆转录病毒等动物病原体,提示RSF体系是微生物学安全的ESCs培养体系。由此我们可知:RSF来源广泛,简便易得,体外增殖能力强,同时不需外源LIF的辅助作用,还是微生物安全的培养体系,可望替代MEF成为ESCs新的培养体系,并且该体系价廉,易得,数量充足,有较大的推广价值,必将有力推动ESCs的基础和临床应用研究。成纤维细胞与间充质干细胞(MSC)形态相似,且均为中胚层来源,而后者已显示出多种分化潜能,故而为探讨RSF的分化潜能,我们对其进行了成骨、成脂、平滑肌诱导和肝细胞诱导的初步研究。经AKP和Von Kossa染色表明,RSF可诱导为成骨细胞,RT-PCR分析也进一步证实了其成骨潜能;油红染色显示,经常规脂肪诱导和低血清bFGF诱导,均可引起高比例脂肪细胞分化;糖原染色证实RSF亦可跨胚层分化为肝细胞;此外RT-PCR显示,RA诱导RSF细胞平滑肌分化后,有平滑肌特异标志物表达。综上所述,我们所获得的RSF细胞是一类具有多功能性的细胞,不但显示出强大的ESCs支持能力,并且具有多向分化潜能,包括分化为同胚层的成骨、脂肪细胞、平滑肌细胞,以及跨胚层分化为肝细胞,其分化谱及分化机制还有待进一步阐明。

全文目录


致谢  3-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-33
  1 引言  12-13
  2、Instructive interactions&neural induction  13
  3、神经诱导的默认分化途径  13-15
  4、神经诱导的其他信号途径  15-19
  5、哺乳动物ES细胞的神经诱导  19-22
  6、神经干细胞的发生  22-24
  7、ES细胞的神经诱导及其在再生医学中的应用  24-26
  8、展望  26-27
  参考文献  27-33
第二章 小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞对帕金森病模型小鼠的移植研究  33-62
  1、前言  33-34
  2、材料和方法  34-49
    2.1 材料  34-37
      2.1.1 实验动物及主要细胞系  34
      2.1.2 主要试剂  34-35
      2.1.3 主要仪器  35-37
    2.2 方法  37-49
      2.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养  37-39
      2.2.2 小鼠胚胎干细胞的培养、传代及冻存  39-40
      2.2.3 小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞分化  40-44
      2.2.4 帕金森病模型小鼠的建立  44
      2.2.5 ES来源的神经细胞向PD模型小鼠移植  44-49
  3、结果  49-51
    3.1 无血清诱导神经前体细胞的形态观察  49-50
    3.2 诱导过程的基因表达分析及免疫细胞化学鉴定  50
    3.3 小鼠帕金森病模型的评价  50-51
    3.4 纹状体移植区域TH阳性细胞的检测  51
    3.5 HPLC多巴胺水平分析  51
    3.6 移植区域畸胎瘤形成及组织学分析  51
  4、讨论  51-54
  图版Ⅰ  54-58
  参考文献  58-62
第三章 兔脾来源的成纤维样细胞对小鼠胚胎干细胞的支持作用研究  62-83
  1、前言  62-63
  2、材料和方法  63-71
    2.1 材料  63-65
      2.1.1 实验动物及主要细胞系  63
      2.1.2 主要试剂  63-64
      2.1.3 主要仪器  64-65
    2.2 方法  65-71
      2.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离和培养  65
      2.2.2 兔脾成纤维细胞(RSF)的分离、培养及冻存  65
      2.2.3 MEF及RSF生长曲线的比较  65-66
      2.2.4 无LIF条件下RSF对小鼠胚胎干细胞的维持试验  66
      2.2.5 小鼠胚胎干细胞的碱性磷酸酶染色(AKP)  66-67
      2.2.6 小鼠胚胎干细胞的核型分析  67-68
      2.2.7 mESCs-RSF细胞的全能性分析  68-69
      2.2.8 透射电镜(TEM)分析  69
      2.2.9 免疫细胞化学染色及RT-PCR分析  69-71
  3 结果  71-73
    3.1 兔脾来源的成纤维样细胞(RSFs)的形态学观察及生长特性  71
    3.2 无LIF—RSF对小鼠胚胎干细胞的支持作用  71-72
    3.3 RSF-LIF(-)条件下mESCs细胞的特性鉴定  72
    3.4 RSF-LIF(-)条件下mESCs细胞的全能性分析  72
    3.5 RSF细胞的维持机制分析  72-73
    3.6 透射电镜分析  73
  4 讨论  73-76
  图版Ⅱ  76-80
  参考文献  80-83
第四章 兔脾来源的成纤维样细胞多向分化能力的初步研究  83-100
  1、前言  83-84
  2、材料和方法  84-89
    2.1 材料  84-86
      2.1.1 实验动物及主要细胞系  84
      2.1.2 主要试剂  84-85
      2.1.3 主要仪器  85-86
    2.2 方法  86-89
      2.2.1 RSF细胞的复苏和培养  86
      2.2.2 RSF的诱导实验  86-87
      2.2.3 RSF细胞向脂肪细胞的诱导实验  87
      2.2.4 RSF细胞向肝细胞的诱导实验  87-88
      2.2.5 RSF细胞向平滑肌细胞的诱导实验  88-89
      2.2.6 RT-PCR分析  89
  3、结果  89-91
    3.1 RSF细胞向成骨细胞分化的形态学观察及特征鉴定  89-90
    3.2 RSF细胞向脂肪细胞分化的形态学观察及特征鉴定  90
    3.3 bFGF在RSF脂肪诱导中的作用  90-91
    3.4 RSF细胞向肝细胞分化的形态学观察及特征鉴定  91
    3.5 RSF细胞向平滑肌细胞分化的形态学观察及特征鉴定  91
  4、讨论  91-93
  图版Ⅲ  93-97
  参考文献  97-100
附录  100-107
  1 创新性  100-101
  2 主要试剂配方  101-105
  3 缩略词表  105-107
发表论文  107

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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