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肉苁蓉细胞培养与次生代谢物形成的研究

作　者: 吕建军
导　师: 贾景明
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 中药学
关键词: 肉苁蓉愈伤组织细胞悬浮培养真菌诱导子前体苯乙醇苷松果菊苷抗氧化活性
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本论文运用植物细胞培养技术，以荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola Y．C．Ma）种子作为外植体，诱导出愈伤组织，进行继代培养，建立了稳定的荒漠肉苁蓉愈伤组织和细胞悬浮培养体系；较系统研究了多种前体化合物和真菌诱导子对荒漠肉苁蓉悬浮培养细胞干重（Dry Weight,DW）、苯乙醇苷（Phenylethanoid Glycosides,PeGs）含量和松果菊苷（Echinacoside,Echin）含量的影响。在本研究条件下，对培养物进行了质量控制和体外抗氧化活性初步研究。愈伤组织最佳培养条件为：MS+YE 800mg／L+NAA1．0mg／L+6-BA1．5mg／L+2,4-D0．5mg／L+蔗糖30g／L+琼脂6．5g/L，pH值：5．8，光照时间：12h／d，光照强度：58．4μmol·m^-2·s^-1，培养温度：26±1℃。实验结果表明，新鲜的浅黄色疏松肉苁蓉愈伤组织为次生代谢物高产细胞系。在培养的第24d细胞干重达到最大12．720 gDW／L，PeGs和Echin含量在第20d达到最大值，分别为11．467和6．041mg/g。细胞悬浮培养条件为：MS+YE 800 mg/L+NAA 2．0 mg／L+6-BA 0．5 mg／L+2,4-D 0．2mg／L+蔗糖30g／L，pH值：5．8，光照时间：12h／d，光照强度：58．4μmol·m^-2·s^-1，培养温度：26±1℃，摇床转速：110rpm，接种浓度：3．2gDW／L。实验结果表明，悬浮培养条件下细胞干重、PeGs及Echin含量均在20d达到最大，分别为8．108 gDW／L、12．105和5．980mg/g。研究表明真菌诱导子的添加能促进肉苁蓉悬浮细胞干重、PeGs及Echin含量的提高。选用的6种真菌诱导子中以真菌番茄霉菌（Cladosporium fulvum,C.fulvum）最佳，在细胞生长的第16d加入浓度为80 mg/L的C.fulvum，6d后取样测得肉苁蓉悬浮细胞干重、PeGs及Echin含量均达到最大值，分别为14．055gDW／L、18．981和7．230mg/g。研究表明在肉苁蓉悬浮培养细胞第0d，联合加入前体L-苯丙氨酸和L-酪氨酸比单独加入效果更好。联合添加0．330g／L L-苯丙氨酸和0．362g/L L-酪氨酸，第20d取样，细胞干重、PeGs和Echin含量分别为12．320gDW／L、48．500和20．180mg/g。本研究在前体饲喂和真菌诱导子的联合作用实验中，肉苁蓉细胞悬浮培养第0d加入0．330g／L L-苯丙氨酸和0．362g／L L-酪氨酸，培养到第16d时，再加入80mg／L的C.fulvum，继续培养，到第22d取样。细胞干重、PeGs及Echin含量均达到最大值，分别为14．691gDW／L、50．547和23．860mg/g，分别是不添加任何前体和诱导子的1．812、4.176和3．990倍。同时，PeGs和Echin含量分别是野生肉苁蓉的6．230、7．187倍。结果表明前体和诱导子的联合作用能显著提高肉苁蓉细胞悬浮培养体系中次生代谢物的含量。采用抑制肝微粒体脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）生成的方法，首次对比研究肉苁蓉细胞悬浮培养物和野生肉苁蓉的抗氧化活性。通过对脂质过氧化产物MDA的检测，结果表明肉苁蓉细胞悬浮培养物的抗氧化活性随浓度的增加而增强，当肉苁蓉细胞悬浮培养物和野生肉苁蓉醇提物浓度为0．04mg／mL和0．2mg／mL时，都具有很强的抗氧化活性，能够抑制MDA的生成。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
缩略语说明  14-15
第一章前言  15-17
第二章肉苁蓉生物学特性、药理作用、化学成分及细胞培养研究进展  17-29
  2.1 生物学特性及其资源概况  17-21
  2.2 药理作用研究进展  21-23
  2.3 化学成分研究进展  23-26
  2.4 肉苁蓉组织细胞培养及次生代谢物的调控研究进展  26-29
第三章肉苁蓉愈伤组织诱导及培养体系的建立  29-37
  3.1 仪器与试剂  29-30
  3.2 实验材料  30
  3.3 实验方法  30-31
  3.4 实验结果  31-35
    3.4.1 不同培养基配方对诱导愈伤组织的影响  31-32
    3.4.2 愈伤组织的生长动态  32-33
    3.4.3 不同颜色愈伤组织干重、PeGs及Echin含量的差异  33-34
    3.4.4 不同培养基对愈伤组织干重、PeGs及Echin含量的影响  34-35
    3.4.5 肉苁蓉愈伤组织与野生肉苁蓉中活性成分的比较  35
  3.5 讨论  35-37
第四章肉苁蓉细胞悬浮培养体系的建立  37-44
  4.1 仪器与试剂  37-38
  4.2 实验材料  38
  4.3 实验方法  38-39
  4.4 实验结果  39-42
    4.4.1 不同接种浓度对肉苁蓉细胞悬浮培养的影响  39-40
    4.4.2 悬浮培养细胞干重、PeGs和Echin含量变化曲线  40-41
    4.4.3 细胞悬浮培养液pH值的变化  41-42
  4.5 讨论  42-44
第五章真菌诱导子对肉苁蓉细胞悬浮培养影响的研究  44-50
  5.1 仪器与试剂  44-45
  5.2 实验材料  45
  5.3 实验方法  45-46
  5.4 实验结果  46-49
    5.4.1 不同种类真菌诱导子对肉苁蓉细胞悬浮培养的影响  46-47
    5.4.2 不同浓度C.fulvum对肉苁蓉细胞悬浮培养的影响  47-48
    5.4.3 不同培养时期加入C.fulvum对肉苁蓉细胞悬浮培养的影响  48-49
  5.5 讨论  49-50
第六章前体及其与真菌诱导子联合作用对肉苁蓉细胞悬浮培养影响的研究  50-57
  6.1 仪器与试剂  50-51
  6.2 实验材料  51
  6.3 实验方法  51
  6.4 实验结果  51-56
    6.4.1 前体饲喂对肉苁蓉细胞悬浮培养的影响  52-53
    6.4.2 前体和诱导子联合加入对肉苁蓉细胞悬浮培养的影响  53-54
    6.4.3 肉苁蓉细胞悬浮培养物和野生肉苁蓉中活性成分的比较  54-56
  6.5 讨论  56-57
第七章肉苁蓉细胞悬浮培养物体外抗氧化活性的初步研究  57-61
  7.1 材料与方法  57-58
  7.2 实验结果  58-59
    7.2.1 肉苁蓉细胞悬浮培养物与野生肉苁蓉抗氧化活性的比较  59
  7.3 讨论  59-61
第八章结论  61-62
参考文献  62-69
致谢  69-70
发表论文  70

肉苁蓉细胞培养与次生代谢物形成的研究

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