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葡萄（Vitis vinifera L.）细胞悬浮培养基和培养条件的优化

作　者: 崔兴华
导　师: 李兴林
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 葡萄白藜芦醇含量愈伤组织细胞悬浮培养 HPLC
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 25次
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内容摘要

为了探索工业化生产植物次生代谢产物白藜芦醇的新途径,本文以巨峰葡萄(Vitis vinifera L.)幼苗细胞为研究对象,以建立并优化葡萄幼苗细胞悬浮培养体系为研究目标。通过单因子试验和正交试验等,分别对葡萄愈伤组织诱导、悬浮细胞系的初步建立、细胞悬浮培养基及其培养条件的优化等方面进行了研究。本实验以葡萄的叶、叶柄和茎分别作为外植体,在不同激素组合的培养基上进行愈伤组织的诱导和继代培养；并利用获得的松散的愈伤组织在不同条件下建立细胞悬浮培养体系；在整个过程中利用高效液相色谱法(HPLC)测定白藜芦醇的含量。以葡萄叶为外植体时,诱导的愈伤组织的出愈率很低,均在10%以下,以叶柄和茎为外植体时,愈伤组织的出愈率均大于65%,且叶柄的愈伤组织最高诱导率为96.7%,茎的愈伤组织最高诱导率为94.2%。利用叶柄和茎获得松散愈伤组织时其诱导培养基组成分别是：B5培养基+6-BA0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L和B5培养基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2 mg/L,其继代培养基均为B5培养基+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。通过单因子及正交试验结果表明,葡萄细胞悬浮培养最佳的培养体系为：以叶柄在基本培养基B5+0.1mg/L NAA+1.Omg/L 2,4-D上诱导的愈伤组织为起始细胞；接种量为40%(20mL液体接种8mL)；25℃、振荡速度为110r/min、遮光培养；并在培养的第3d添加2mL的1mol/L的蛋白胨溶液、第8d添加4mL的1mol/L蔗糖溶液。此时的总白藜芦醇达到203.7μg/20mL,细胞干重为62.5mg/mL。本文通过葡萄形成愈伤组织外植体的筛选、松散型愈伤组织的获得和细胞悬浮培养基和培养条件的优化,为大规模工业化生产白藜芦醇积累了初步的实验参数。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-21
  1.1 植物细胞悬浮培养的发展与现状  9
  1.2 植物细胞悬浮培养的特点  9-10
  1.3 植物细胞悬浮培养体系的建立  10-12
    1.3.1 愈伤组织的诱导  10-11
    1.3.2 悬浮培养的起始  11
    1.3.3 悬浮培养的继代  11
    1.3.4 悬浮培养的同步化  11-12
  1.4 培养悬浮细胞生长的测定  12-13
    1.4.1 悬浮细胞重量的测定  13
    1.4.2 悬浮液压缩细胞体积(PVC)的测定  13
    1.4.3 悬浮培养系中细胞密度的测定  13
  1.5 影响细胞悬浮培养的条件  13-16
    1.5.1 光照  13
    1.5.2 温度  13-14
    1.5.3 培养基的pH  14
    1.5.4 环境中的空气成分  14
    1.5.5 接种量  14-15
    1.5.6 剪切力  15
    1.5.7 激素水平  15-16
    1.5.8 糖浓度  16
  1.6 葡萄细胞悬浮培养  16
  1.7 白藜芦醇的性质  16-17
  1.8 白藜芦醇的提取  17
  1.9 白藜芦醇的测定方法  17-18
  1.10 白藜芦醇的药用价值  18-19
  1.11 制备白藜芦醇的途径  19
  1.12 白藜芦醇的应用现状及前景  19-20
    1.12.1 白藜芦醇在保健食品方面的应用  19
    1.12.2 白藜芦醇在化妆品中的应用  19
    1.12.3 白藜芦醇在药物上的应用  19-20
  1.13 本论文研究的目的和主要内容  20-21
    1.13.1 本论文研究的目的和意义  20
    1.13.2 本论文研究的内容  20-21
2 材料与方法  21-30
  2.1 试验原料  21
  2.2 试验试剂与仪器  21-22
    2.2.1 试验试剂  21-22
    2.2.2 实验仪器与设备  22
  2.3 葡萄外植体愈伤组织的诱导与继代  22-25
    2.3.1 葡萄外植体部位的选择及预处理  23
    2.3.2 葡萄外植体诱导愈伤组织与诱导培养基的选择  23-24
    2.3.3 葡萄愈伤组织的继代与继代培养基的选择  24-25
  2.4 葡萄细胞悬浮培养体系的建立与继代  25
    2.4.1 悬浮培养体系细胞密度的测定  25
    2.4.2 悬浮培养体系细胞生长曲线的制作  25
    2.4.3 悬浮细胞体系细胞干重的测定  25
  2.5 葡萄细胞悬浮培养体系总糖含量的测定  25-26
    2.5.1 葡萄糖标准曲线的制作  25-26
    2.5.2 悬浮培养体系总糖含量的测定  26
  2.6 葡萄细胞悬浮培养体系白藜芦醇含量的测定  26-27
    2.6.1 白藜芦醇标准曲线的制作  26
    2.6.2 悬浮培养体系中白藜芦醇的提取方法  26-27
    2.6.3 悬浮培养体系中白藜芦醇含量的测定方法  27
  2.7 葡萄悬浮培养体系pH的测定  27
  2.8 在一个悬浮培养周其中悬浮培养体系各个因子的变化规律  27
  2.9 影响葡萄细胞悬浮培养的各个单因素试验  27-28
    2.9.1 不同激素培养对悬浮培养体系的影响  27
    2.9.2 光照强度和外植体部位对悬浮培养体系的影响  27-28
    2.9.3 不同接种量对悬浮培养体系的影响  28
    2.9.4 培养基初始pH对悬浮培养体系的影响  28
    2.9.5 温度对悬浮培养体系的影响  28
    2.9.6 摇床震荡速度对悬浮培养体系的影响  28
    2.9.7 不同碳源对悬浮培养体系的影响  28
    2.9.8 不同氮源对悬浮培养体系的影响  28
  2.10 影响葡萄细胞悬浮培养各个因素的正交试验  28-29
  2.11 悬浮培养体系中碳源和氮源的添加时期和添加量的测定  29-30
    2.11.1 悬浮培养体系中蔗糖的添加时期和添加量的测定  29
    2.11.2 悬浮培养体系中蛋白胨的添加时期和添加量的测定  29-30
3 结果与讨论  30-55
  3.1 葡萄糖与白藜芦醇含量的标准曲线  30-31
    3.1.1 葡萄糖标准曲线  30
    3.1.2 白藜芦醇浓度标准曲线  30-31
  3.2 葡萄愈伤组织的诱导与继代培养  31-36
    3.2.1 葡萄愈伤组织的诱导  31-33
    3.2.2 葡萄愈伤组织的继代培养  33-35
    3.2.3 葡萄外植体和其愈伤组织培养过程中白藜芦醇的积累  35-36
  3.3 葡萄悬浮培养的细胞生长曲线和测定指标的变化  36-38
    3.3.1 悬浮培养的细胞密度变化  36-37
    3.3.2 悬浮培养的细胞干重、白藜芦醇含量、总糖利用率和pH变化  37-38
  3.4 葡萄细胞悬浮培养的培养基筛选及其培养条件优化  38-55
    3.4.1 确定不同外植体适宜的激素组合与光照需求  38-44
    3.4.2 接种量对悬浮培养体系的影响  44-45
    3.4.3 培养基初始pH对悬浮培养体系的影响  45
    3.4.4 温度对悬浮培养体系的影响  45-47
    3.4.5 摇床震荡速度对悬浮培养体系的影响  47
    3.4.6 碳源对悬浮培养体系的影响  47-48
    3.4.7 氮源对悬浮培养体系的影响  48-49
    3.4.8 葡萄细胞悬浮培养主要影响因子的正交试验  49-52
    3.4.9 碳源和氮源的添加时间和添加量对悬浮细胞培养体系的影响  52-55
4 结论  55-56
5 展望  56-57
6 参考文献  57-63
7 攻读硕士学位期间论文发表情况  63-64
8 致谢  64

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