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β淀粉样蛋白基因表达载体的构建及转化

作　者: 贺建华
导　师: 夏秀英
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: β淀粉样蛋白表达载体转基因烟草
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 96次
引　用: 1次
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内容摘要

β淀粉样蛋白(amyloidβpeptide,Aβ)是治疗阿尔兹海默氏病的关键靶标之一。目前免疫治疗使用的免疫原Aβ主要通过化学方法合成,生产成本高且免疫性弱,不能满足科研和医疗对免疫原的需求。基因工程技术为高免疫性Aβ的大量生物合成提供了有效途径。本文构建了Aβ串联基因的真核及原核表达载体,研究了Aβ基因在大肠杆菌的表达并获得了转基因烟草,为利用基因工程技术生产Aβ疫苗奠定了基础。本实验依据人类Aβ基因序列及重叠PCR技术原理设计引物,通过PCR扩增获得2个Aβ基因串联的DNA片段(2Aβ);将此片段克隆到载体pGEX-6P-1(GST)中,构建了原核表达载体pGEX-6P-1-Aβ;将此载体转化大肠杆菌BL21并进行蛋白诱导表达;利用GST抗体进行的Western杂交检测结果显示,GST/Aβ融合蛋白能在大肠杆菌中表达,但表达量低而且有降解。为提高外源基因在植物中的表达水平,本实验构建了含双CaMV35S启动子及TEV增强子的植物表达载体pBIDST(d35S-tev/gus);转基因烟草的GUS组织化学染色结果初步表明,d35S-tev驱动的gus基因的表达水平高于CaMV35S。为进一步研究Aβ基因在植物中的表达情况及在不同启动子驱动下的表达差异,构建了含2Aβ基因的植物表达载体pBI121-Aβ和pBIDST-Aβ,通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得了抗性植株,PCR和RT-PCR检测结果证实,不同启动子驱动的2Aβ基因已整合进烟草基因组中并进行了转录。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-10
1 文献综述  10-23
  1.1 阿尔茨海默病简介  10-11
  1.2 Aβ在阿尔茨海默病中的作用  11-13
    1.2.1 Aβ的分子结构特征及产生  11-12
    1.2.2 Aβ的神经毒性  12
    1.2.3 Aβ与炎症反应  12-13
  1.3 以Aβ为靶标治疗阿尔茨海默病的研究进展  13-18
    1.3.1 抑制Aβ产生和沉积  13-14
    1.3.2 抗氧化作用  14-15
    1.3.3 抗炎症治疗  15
    1.3.4 Aβ免疫治疗  15-18
  1.4 转基因植物疫苗的研究进展  18-22
    1.4.1 转基因植物疫苗的特点  18-20
    1.4.2 转基因植物疫苗存在的问题及解决方案  20-21
    1.4.3 Aβ植物疫苗的研究现状  21-22
  1.5 本研究的目的和意义  22-23
2 β淀粉样蛋白基因原核表达载体的构建及表达  23-37
  2.1 实验材料和试剂  23-24
    2.1.1 实验材料  23
    2.1.2 实验试剂  23-24
  2.2 实验方法  24-31
    2.2.1 质粒DNA的小量提取  24-25
    2.2.2 重叠PCR法克隆Aβ串联基因  25-28
    2.2.3 原核表达载体pGEX-6P-1-Aβ的构建  28-29
    2.2.4 Aβ串联基因在E.coli BL21中的诱导表达及检测  29-31
  2.3 结果与分析  31-35
    2.3.1 2Aβ基因片段的克隆  31-33
    2.3.2 原核表达载体pGEX-6P-1-Aβ的构建  33-34
    2.3.3 2Aβ蛋白表达  34-35
  2.4 讨论  35-36
  2.5 小结  36-37
3 含双35S启动子和TEV增强子的植物表达载体的构建  37-53
  3.1 实验材料和试剂  37-38
  3.2 实验方法  38-46
    3.2.1 载体pBIDST的构建  38-44
    3.2.2 工程菌的获得  44
    3.2.3 农杆菌介导的叶盘转化  44-45
    3.2.4 转化植株的PCR检测  45-46
    3.2.5 GUS组织化学染色  46
  3.3 结果与分析  46-52
    3.3.1 载体pBIDST的构建  46-50
    3.3.2 转基因抗性烟草的获得  50
    3.3.3 转基因烟草的分子检测  50-51
    3.3.4 转基因植株GUS组织化学染色检测  51-52
  3.4 讨论  52
  3.5 小结  52-53
4 Aβ基因植物表达载体的构建及转化  53-66
  4.1 实验材料和试剂  53
  4.2 实验方法  53-59
    4.2.1 2Aβ基因植物表达载体的构建  53-57
    4.2.2 烟草转化及抗性芽筛选  57
    4.2.3 抗性植株PCR检测  57-58
    4.2.4 烟草叶片RNA提取  58
    4.2.5 抗性植株RT-PCR检测  58-59
  4.3 结果与分析  59-64
    4.3.1 2Aβ基因植物表达载体的构建  59-61
    4.3.2 转基因烟草的获得  61-62
    4.3.3 转基因烟草的PCR检测  62-64
    4.3.4 转基因烟草的RT-PCR检测  64
  4.4 讨论  64-65
  4.5 小结  65-66
结论  66-67
参考文献  67-72
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  72-73
致谢  73-74

β淀粉样蛋白基因表达载体的构建及转化

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