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青枯菌PopW蛋白诱导植物抗病功能研究及其转基因烟草的构建

作　者: 曹静
导　师: 郭坚华
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: popW基因 Harpin IPTG浓度 诱导抗性 转基因烟草
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌Hrp(hrp,hypersensitive response and pathogenity)基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质,富含甘氨酸,缺少半胱氨酸,对蛋白酶敏感,对热稳定,大多对寄主植物具有毒性,导致寄主发病,能在非寄主植物上引起过敏反应(hypersensitive response,HR)增强植物抗旱性,诱导植物抗病、抗虫,还可以促进植物生长。popW是本实验室从青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ3721中鉴定出的编码一种新的harpin蛋白大小为1142bp的基因,其编码的PopW蛋白是一种新的harpin蛋白,它同以前报道的harpin类物质具有相同的性质：酸性,富含甘氨酸和丝氨酸,缺少半胱氨酸并且是一种耐热蛋白。通过对PopW蛋白原核表达条件的优化发现：随着IPTG浓度的增加,诱导表达的蛋白含量也会随之增加,当IPTG的浓度为0.03 mM,诱导表达的蛋白含量最高,若继续增加IPTG的浓度,蛋白的表达量反而下降。但鉴于成本因素,而且0.01 mM的诱导效果与0.03mM并无显著差异,因此在后续试验中均采用0.01 mM作为IPTG诱导浓度。有研究表明PopW能够诱导植物产生系统抗性,并且该抗性属于水杨酸介导的SAR。本文用不同浓度的PopW蛋白喷雾处理烟草,24h后接种烟草花叶病毒(Tobacco Mosiac Virus,TMV),结果显示PopW处理叶片上的枯斑数目显著少于对照叶片。2.5 mg/L、25 mg/L、250 mg/L的PopW蛋白均有较好的诱抗效果,其诱导烟草抗TMV的效果分别达到36.24%、64.53%、85.39%,并且随浓度增加,叶片上枯斑数逐渐减少。同时浓度为2.5 mg/L的PopW蛋白的持效性至少达8天。此外,在田间试验中发现浓度为2.5 mg/L的PopW蛋白对番茄叶霉病和水稻稻曲病的防效分别为80.19%和86.84%,它除了具有诱导抗病性外还可以促进植物生长,提高作物的产量的作用。用PopW蛋白处理的辣椒,其产量为999.8 kg/亩,较对照产量增加16.89%。鉴于PopW蛋白的诱导抗病性功能,我们构建了popW的转基因烟草,以进一步研究其在烟草中的表达及抗病性植物效应。从青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ3721中克隆popW基因,连接到用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后的转基因表达载体pBI121上,构建成重组转基因载体pBI121-popW。重组载体转化至大肠杆菌TOP10中,经测序验证后,通过冻融法将重组载体转化根癌土壤杆菌EHA105。经PCR和酶切验证后,挑选阳性克隆供转化烟草使用。利用叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum.cv.Xanthi NN),用卡那霉素抗性筛选再生植株。PCR扩增检测转基因烟草中的靶基因序列popW及35S启动子序列,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中,得到T0代转基因烟草,利用RT-PCR检测到popW在转基因烟草中能正常表达。

全文目录


目录  5-10摘要  10-12ABSTRACT  12-14上篇 文献综述  14-36  第一章 hrp基因及其编码的Harpin蛋白的特性  15-21    1 植物病原细菌的hrp基因和Harpin蛋白  15-17    2 Harpin在植物上的有益效应  17-21      2.1 诱导植物抗病性  18-19      2.2 诱导植物的抗虫性  19      2.3 诱导植株抗旱反应  19      2.4 增加植物产量  19-21  第二章 植物病毒病的生物防治研究进展  21-27    1 植物病毒病概述  21-22    2 植物病毒病的主要防治方法  22-24      2.1 预防为主,综合防治  22      2.2 选育和推广应用抗病良种  22-23      2.3 化学防治  23      2.4 生物防治  23-24    3 生防制剂防治病毒病研究进展  24-27      3.1 我国生物农药的发展现状与研究进展  24      3.2 蛋白质农药防治病毒病研究进展  24-27  第三章 转基因植物研究进展  27-36    1 植物遗传转化方法  27-33      1.1 土壤杆菌介导的基因转移  27-30        1.1.1 叶盘转化法  29-30        1.1.2 原生质体共培养转化法  30        1.1.3 整株感染法  30      1.2 DNA直接导入的基因转化技术  30-32        1.2.1 聚乙二醇(PEG)介导的基因转化  30        1.2.2 基因枪法  30-31        1.2.3 脂质体介导法  31        1.2.4 电穿孔法  31        1.2.5 微注射法  31        1.2.6 超声波介导法  31-32        1.2.7 低能离子束介导法  32      1.3 种质系统的基因转移  32-33        1.3.1 子房注射法  32        1.3.2 花粉管通道  32-33    2 转基因技术的应用  33-34      2.1 转基因技术在植物遗传改良上的应用  33      2.2 转基因技术在医药上的应用  33-34      2.3 转基因技术在环境保护上的应用  34      2.4 转基因技术在食品工业上的应用  34    3 转基因产品的潜在风险  34-35    4 小结  35-36下篇 研究内容  36-87  第一章 青枯劳尔氏菌PopW蛋白诱导植物抗病性研究  37-57    1 材料与方法  39-46      1.1 植物、病原物及PopW的制备  39-40        1.1.1 菌株和植物  39        1.1.2 病原菌以及其接种方法  39        1.1.3 PopW抗菌蛋白制备  39-40      1.2 常用试剂配制  40-42        1.2.1 培养基  40        1.2.2 缓冲液  40-41        1.2.3 SDS-PAEG胶的制备  41-42      1.3 不同IPTG浓度对PopW蛋白表达量的影响  42      1.4 不同浓度PopW蛋白对烟草抗病性影响  42-43      1.5 PopW蛋白诱导烟草对TMV抗病性最佳诱导时期和持效期  43      1.6 PopW蛋白诱导植物PR-1α基因表达检测  43-45        1.6.1 植物RNA的提取(Trizol法)  43        1.6.2 sscDNA的合成  43-44        1.6.3 引物的设计  44-45      1.7 PopW蛋白大曰防病、促生试验  45-46        1.7.1 PopW蛋白对番茄叶霉病的防治  45        1.7.2 PopW蛋白对水稻稻曲病的防治  45-46        1.7.3 PopW蛋白大田促生试验  46      1.8 数据分析  46    2 结果与分析  46-52      2.1 不同IPTG浓度梯度对PopW蛋白表达量的影响  46-48      2.2 PopW蛋白诱导烟草对TMV抗病性的最佳浓度  48-49      2.3 PopW蛋白诱导抗病性持效性  49-50        2.3.1 PopW蛋白诱导烟草对TMV抗病性最佳诱导时期和持效期  49        2.3.2 PopW蛋白诱导抗病性与priming(引发效应)相关  49-50      2.4 PopW蛋白大田防治试验  50-52        2.4.1 PopW蛋白对番茄叶霉病的防治效果  50-51        2.4.2 PopW蛋白对水稻稻曲病的防治效果  51-52      2.5 PopW蛋白大田促生试验  52    3. 讨论  52-57  第二章 烟草转popW基因载体的构建  57-75    1 材料和方法  58-70      1.1 材料  58-59        1.1.1 菌株  58-59        1.1.2 主要试剂  59        1.1.3 培养基  59      1.2 目的基因的克隆  59-63        1.2.1 青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组DNA的提取  59-60        1.2.2 目的基因的克隆  60        1.2.3 目的基因的PCR扩增及产物纯化  60-61        1.2.4 PCR产物与克隆载体的连接  61        1.2.5 大肠杆菌感受态的制备  61-62        1.2.6 连接产物的转化  62        1.2.7 质粒提取  62-63        1.2.8 酶切验证  63      1.3 植物表达载体的构建  63-67        1.3.1 大量提取质粒  63-65        1.3.2 琼脂糖电泳分析  65        1.3.3 质粒酶切  65-66        1.3.4 琼脂糖凝胶DNA片段回收  66        1.3.5 将目的基因连接到pBI121载体上  66-67      1.4 重组质粒的验证  67-70        1.4.1 大肠杆菌感受态的制备  67-68        1.4.2 连接产物的转化  68        1.4.3 菌落PCR验证  68-69        1.4.4 质粒提取  69        1.4.5 酶切验证  69-70        1.4.6 重组质粒测序验证  70      1.5 重组质粒导入土壤杆菌  70        1.5.1 土壤杆菌感受态细胞的制备  70        1.5.2 土壤杆菌感受态细胞的转化  70        1.5.3 转化子的鉴定  70    2 结果和分析  70-73      2.1 目的基因popW的克隆  70-71      2.2 植物表达载体的构建  71-72      2.3 重组质粒的验证和转化  72-73    3 讨论  73-75  第三章 转基因烟草的产生和鉴定  75-87    1 材料和方法  76-82      1.1 植物和微生物材料  76      1.2 抗生素和生长素  76      1.3 培养基  76-77      1.4 转基因烟草的产生  77      1.5 转基因烟草的PCR检测  77-79        1.5.1 烟草基因组DNA的提取  77-78        1.5.2 PCR扩增引物  78        1.5.3 PCR扩增反应体系  78-79        1.5.4 PCR扩增反应条件  79        1.5.5 PCR产物的检测  79        1.5.6 PCR产物测序  79      1.6 转基因烟草总RNA的提取及RT-PCR扩增  79-82        1.6.1 转基因烟草总RNA的提取  79-80        1.6.2 RNA的纯化  80        1.6.3 紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度  80-81        1.6.4 RNA的保存  81        1.6.5 逆转录反应合成cDNA  81        1.6.6 RT-RCR  81-82    2 结果与分析  82-85      2.1 转基因烟草的获得  82-83      2.2 转基因烟草的PCR检测  83-84      2.3 PCR产物测序及序列分析结果  84-85      2.4 T1代转基因植株的RT-PCR分析  85    3 讨论  85-87参考文献  87-101缩略语  101-103附录  103-105攻读学位期间完成的学术论文  105-107致谢  107

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 烟草（菸草）
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