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鸭源性E.coli耐药相关基因mRNA表达差异分析及中药对E.coli耐药性的消除试验

作　者: 张奎
导　师: 聂奎
学　校: 西南大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭大肠杆菌 HSP70 aphA 基因表达差异中药耐药性消除
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鸭大肠杆菌病是由某些血清型E.coli引起鸭局部或全身性感染的一类疾病,在临床上表现为大肠杆菌性败血症、大肠杆菌性肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道疾病,CRD)、大肠杆菌蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎、脐炎及卵黄囊感染等,给养鸭业造成了严重的经济损失。抗菌药物在控制鸭大肠杆菌感染方面发挥了重要作用,但随着抗菌药物的大量应用,E.coli的耐药现象日趋严重,大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药株不断出现,不仅给鸭病防治带来了诸多困难,并且鸭源性耐药菌株可通过鸭产品经多种途径将耐药基因或质粒传递给人类的致病菌株,严重威胁着人类健康。因此,对鸭源性E.coli的耐药性进行调查,并对E.coli耐药菌株和敏感菌株的耐药相关基因mRNA表达差异进行分析,开发具有延缓、抑制和消除细菌耐药性的耐药消除剂,对于养鸭业正确合理使用抗菌药物,减少药物残留从而保证动物性食品的安全,防止食源性动物耐药菌将耐药基因或质粒传递给人类致病菌,以及控制细菌耐药性的蔓延都具有重要意义。1鸭源性E.coli的分离鉴定及耐药性分析2007年11月～2008年8月,从重庆部分规模化养鸭场收集发生大肠杆菌病的病死鸭,无菌采集病死鸭的肝脏和心血,经分离培养、染色镜检、生化鉴定,共分离出52株鸭源性E.coli。采用世界卫生组织(WHO)推荐的纸片扩散法(Kirby-Bauer氏法),以大肠杆菌ATCC25922(购自中国药品生物制品检定所)为质控菌株,选用21种常用抗菌药物,按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)的判定标准对分离得到的52株鸭源性E.coli进行药敏实验。试验结果显示,本次分离到的鸭源性E.coli的耐药现象十分严重,对21种抗生素有不同程度的耐药性,耐药率为23.1%～98.1%,鸭源性E.coli对妥布霉素、头孢噻肟、头孢氨苄、卡那霉素和壮观霉素耐药率较低,对阿莫西林、氨苄西林、链霉素、红霉素、四环素、诺氟沙星、磺胺异噁唑耐药率较高;52株鸭源性E.coli均表现为多重耐药,耐10种药物以上的有39株(占75%)。2鸭源性E.coli耐药株aphA和HSP70基因mRNA的表达差异分析磷酸转移酶是E.coli产生对氨基糖苷类药物耐药的3种钝化酶之一,其中aphA基因编码的磷酸转移酶能磷酸化卡那霉素、新霉素、巴龙霉素和丁酰苷菌素,导致E.coli对这类抗生素耐药。试验构建了重组质粒aphA-pMD19-T、含HSP70基因的重组质粒HSP70-pMD19-T以及含有管家基因GAPDH的重组质粒GAPDH-pMD19-T,将其作为标准品进行Real Time PCR,得到较好的的扩增曲线、标准曲线和融解曲线,能准确地对样本中aphA和HSP70基因mRNA表达量进行相对定量。经Real Time RT-PCR检测,发现E.coli耐药菌株的耐药基因mRNA的表达量是敏感菌株的1202倍,说明其耐药基因aphA mRNA表达量的上调,可能是介导该耐药菌株对氨基糖苷类药物耐药的主要因素;并且耐药菌株的HSP70基因mRNA的表达量是敏感菌株的34.21倍,表明E.coli在抗菌药物的胁迫下,热休克蛋白表达量增加,提高E.coli的耐受性,对E.coli具有保护作用。本文认为,可把HSP70作为分子生物标志用于E.coli耐药性的分子流行病学调查。3中药单体对鸭源性E.coli耐药性的消除试验选取6种中药单体(苦参碱、盐酸小檗碱、青蒿素、青藤碱、吴茱萸碱、丹参酮IIA),以两种化学药物(格列本脲、SDS)为对照,采用药物传代培养试验,对临床分离的鸭源耐药性大肠杆菌进行耐药性消除试验。经MIC检测,发现SDS、格列本脲、苦参碱、盐酸小檗碱和青蒿素对试验菌株的MIC分别为200、100、500、250和500μg/mL,而青藤碱、吴茱萸碱、丹参酮IIA对试验菌株无抑菌作用;药敏试验发现,6种中药单体能恢复E.coli耐药菌株对氨曲南、复达欣、阿米卡星、妥布霉素、红霉素、环丙沙星、氧氟沙星和利福平的敏感性。通过对6种中药单体传代菌株部分耐药基因的PCR检测,发现这6种中药单体不能消除氨基糖苷类耐药基因rpsL和整合酶基因加intⅠ,盐酸小檗碱、青蒿素、青藤碱和丹参酮IIA不能消除β-内酰胺类耐药基因blaTEM,但苦参碱(具有抑菌作用)和吴茱萸碱(无抑菌作用)能消除β-内酰胺类耐药基因blaTEM,说明无抑菌作用的中药单体也能消除耐药菌株的部分耐药基因。对药物传代菌株aphA基因mRNA表达水平的检测发现,6种中药单体能不同程度地降低耐药菌株aphA基因mRNA的表达量,可以看出无抑菌作用的中药单体也可以消除耐药菌株的耐药性,表明中药消除耐药性不仅仅是通过抑菌作用,而且还存在其他的耐药消除机制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
第1章文献综述  10-20
  1.1 鸭大肠杆菌病及鸭源性大肠杆菌的耐药现状  10-11
  1.2 大肠杆菌对抗菌药物的耐药机制  11-13
  1.3 耐药基因的检测及基因表达差异分析  13-17
  1.4 中药对细菌耐药性消除的研究  17-20
第2章引言  20-22
第3章重庆地区鸭源性E.coli的分离鉴定及耐药性分析  22-30
  3.1 试验材料  22-23
  3.2 试验方法  23-25
  3.3 试验结果  25-27
  3.4 讨论  27-30
第4章鸭源性E.coli耐药株aphA和HSP70基因mRNA表达差异的分析  30-52
  4.1 试验材料  31-32
  4.2 试验方法  32-38
  4.3 试验结果  38-48
  4.4 讨论  48-52
第5章中药对鸭源性E.coli耐药性消除的试验研究  52-66
  5.1 试验材料  52-54
  5.2 试验方法  54-58
  5.3 试验结果  58-64
  5.4 讨论  64-66
第6章结论与创新点  66-68
参考文献  68-74
附录1 英文缩略词表  74-76
附录2 溶液的配制  76-78
致谢  78-80
攻读硕士期间论文发表情况  80

鸭源性E.coli耐药相关基因mRNA表达差异分析及中药对E.coli耐药性的消除试验

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