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动物源性大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药及其相关机制的研究

作　者: 张晶
导　师: 王全凯
学　校: 吉林农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 氨基糖苷类抗生素 aphA基因耐药菌表达核糖体突变
分类号: S852.612
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

氨基糖苷类抗生素是一类高效广谱的抗生素，由于在临床上得到了广泛应用，细菌对其产生的耐药现象日益严重，导致该类抗生素在治疗中的作用受到了限制，但它的化学结构，活性，药动力学等方面的研究已成熟，半合成的氨基糖苷类抗生素难以在结构上有所改变，所以了解细菌的耐药机制已是刻不容缓。本研究主要经最低抑菌(MIC)测定从临床分离的15株大肠杆菌中筛选2株高度耐药株，4株中度耐药株，1株低程度耐药株，从不同的角度对这7株耐药菌耐药机制进行研究，以期对氨基糖苷类抗生素耐药性的监测、控制作出有益的探索。首先选取钝化氨基糖苷类药物三种酶的五种基因acc(6′)-Ib，acc(3)-Ⅳ，aadA，aphA，aph(2″)对7株耐药菌进行PCR扩增，这几种基因所编码的钝化酶在大肠杆菌中较为常见，但仅有aphA基因扩增成功，所以初步断定引起这几株菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制是aphA编码的磷酸转移酶的作用。然后通过实时荧光定量RT-PCR方法对这7株耐药菌aphA基因mRNA表达水平进行定量检测，方法主要是设计参比引物构建表达载体，提取大肠杆菌的RNA，并反转录，利用所设计的检测引物进行实时荧光定量RT-PCR。结果得出不同耐药强度的大肠杆菌aphA基因mRNA表达水平存在着差异，二者呈正相关，并且通过耐药性和表达水平的差异，推断出这7株菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制是aphA基因产生的磷酸转移酶的钝化作用。同时也通过western blotting的方法对aphA基因蛋白表达进行了定性检测，其方法是将aphA基因克隆表达，将表达后的蛋白作为抗体免疫动物，制备抗体血清，通过western blotting的方法对不同耐药强度的大肠杆菌aphA基因蛋白表达水平进行检测，得出耐药强度同大肠杆菌aphA基因蛋白表达水平成正相关，结论与上述方法相一致。通过上述结果的进一步分析4株中度耐药菌的耐药强度相当，所检测到表达水平也相当，所以引起它们的主要耐药机制就是aphA基因编码钝化酶的作用。高度耐药的两株菌在检测中aphA基因的表达有差异，但它们的耐药强度相当，所以还应有其他的耐药机制存在。为了能更深入了解两株高度耐药菌(7、5号)的差异所在，本实验选取了编码16S rRNA基因rrsA和核糖体蛋白基因rpsL，将其克隆到pGEM-T Easy

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
绪论  8-19
  1 氨基糖苷类药物分子水平上作用机制的研究  8-11
  2 细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药机制的研究进展  11-14
  3 钝化氨基糖苷类药物酶的研究进展  14-19
第一章实时荧光定量RT-PCR检测动物源性大肠杆菌aphA基因mRNA表达水平  19-34
  1．1 材料  19-21
  1．2 方法  21-27
  1．3 结果  27-31
  1．4 讨论与小结  31-34
第二章动物源性大肠杆菌aphA、rrsA、rpsL基因的克隆及大肠杆菌aphA基因蛋白表达水平的检测  34-55
  2．1 材料  34-37
  2．2 方法  37-44
  2．3 结果  44-51
  2．4 讨论与小结  51-55
论文结论  55-56
参考文献  56-61
附录  61-65
致谢  65-66
个人简介  66

动物源性大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药及其相关机制的研究

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