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两个osvdac基因的原核表达及其对水稻的遗传转化

作　者: 秦圣光
导　师: 王春台
学　校: 中南民族大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻 VDAC 原核表达抗体
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)是一种由小的多基因家族编码的离子孔道蛋白,它们主要依赖电压来调节其对阴阳离子的选择性。VDAC主要存在于线粒体膜上,它除了在线粒体的能量代谢和物质代谢中起重要性作用外,还与细胞凋亡的诱发有关。本实验室前期通过生物信息学方法对粳稻日本晴全基因组扫描,发现在日本晴基因组中至少存在8个vdac的同源候选基因。相比在哺乳动物中仅含三个的vdac基因,在水稻中的8个同源vdac基因所编码的蛋白在结构、定位及其生物学功能,值得深入研究。本研究首先克隆获得vdac3和vdac5两个基因的ORF,探讨两个原核高效表达条件和蛋白纯化条件,制备其抗体;与含GFP的植物表达载体重组,遗传转化,期望研究其细胞定位。取得的研究结果如下。1.根据osvdac3和osvdac5设计特异性引物,通过PCR从YTB的cDNA中扩增获得2个vdac基因的ORFs,与含有His标签的原核表达载体pET-30a重组,获得了重组质粒pET-30a-osvdac3和pET-30a-osvdac5;将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,重组蛋白诱导表达的最佳条件为15℃,0.7 mmol/L IPTG诱导17 h;目的蛋白通过亲和层析分离纯化,经SDS-PAGE分析显示为单一带。分离纯化的蛋白质样品,经过其N端的质谱检测分析,结果与预期的2个基因的表达产物一致;用纯化的2个原核表达蛋白进一步制备的抗体,western blot分析表明均具有较好的特异性。2.以获得的vdac3和vdac5基因的ORFs,构建了CaMV35S∷osvdac3∷GFP和CaMV35S∷osvdac5∷GFP过表达载体,以水稻YTA作为其遗传转化的受体,获得一定数量的转化苗,为进一步的组织细胞定位奠定了基础。

两个osvdac基因的原核表达及其对水稻的遗传转化

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