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AnnexinⅡ蛋白的原核表达和AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表达差异研究

作　者: 张丽意
导　师: 阮长耿
学　校: 苏州大学
专　业: 内科学
关键词: Annexin II 原核表达单克隆抗体荧光定量PCR 急性白血病
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Annexin II是钙介导的磷脂结合蛋白超家族成员之一,表达于内皮细胞、单核巨噬细胞、神经细胞和一些肿瘤细胞。Annexin II是纤维蛋白溶解酶原(PLG)和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的共同受体,在血管内皮上能显著增加t-PA介导的纤溶酶形成效率。目前研究发现,Annexin II异常高表达是M3型急性髓系白血病(APL)出血合并症的重要机制之一。此外,研究发现Annexin II还与某些实体肿瘤的侵袭和转移、血管新生密切相关。鉴于Annexin II的重要病理生理功能,本研究旨在基础和临床两方面对Annexin II的功能作进一步探讨。我们用大肠杆菌为宿主表达了Annexin II融合蛋白,并以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,用细胞融合和单克隆筛选技术制备了抗Annexin II单克隆抗体,利用所制备的单克隆抗体初步建立了流式方法检测细胞表面Annexin II蛋白的表达水平;此外还运用荧光定量PCR(Rea1-time PCR)方法对急性白血病细胞株以及急性白血病病人骨髓单个核细胞Annexin II mRNA的表达水平进行了测定和比较,以进一步探索Annexin II的功能及可能的作用机制。1. AnnexinⅡ蛋白的原核表达我们利用含有Annexin II全长cDNA的质粒pET-T1/C2-Annexin II转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达目的蛋白。原核表达的重组Annexin II相对分子量约39kDa,经Ni-NTA agarose柱纯化获得了部分纯化的蛋白后免疫Balb/c小鼠。小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合后筛选获得二株持续分泌单克隆抗体的细胞株,命名为SZ-135和SZ-136。两株杂交瘤细胞单克隆后接种小鼠腹腔产生腹水,间接ELISA法测定其效价分别为5×10-5和6×10-5。琼脂糖双扩散法显示两株抗体皆为IgG1亚类。腹水经蛋白G-Sephrose4B亲和层析柱纯化后浓度分别为0.25mg/ml和0.5mg/ml。Western blot分析显示两株单抗均能够识别相对分子量为39kDa的重组蛋白且能够特异性地识别还原条件下NB4和U937细胞裂解液中分子量约36kDa的蛋白。本研究制备出抗Annexin II的特异性单克隆抗体,经过鉴定表明该抗体具有较高的特异性和亲和力,对于进一步探讨Annexin II的功能具有重要意义。2.Annexin II在急性白血病患者中的表达差异及临床意义本研究探讨急性白血病患者骨髓细胞Annexin II基因的表达水平。建立荧光定量PCR(Rea1-time PCR)方法,检测急性白血病细胞患者骨髓单个核细胞Annexin II mRNA的表达水平。实验结果显示:Annexin II在NB4中的表达明显高于其它细胞株,在U937以及SHI-1中也有较高表达。Annexin II在初治M3型急性白血病患者骨髓中的表达显著高于其它类型急性白血病和正常对照者,此外在初治M5、M4患者骨髓中也有较高表达,而在初治M1以及M2患者中表达量与正常对照比无统计学差异。结论:Annexin II除在M3中高表达外,在临床观察具有高度侵袭浸润能力的类型M5、M4中也有较高表达,推测Annexin II可能通过作为纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活剂的共同受体,促进纤溶酶的生成,从而起动蛋白水解级联反应,选择性降解细胞外基质蛋白参与急性白血病的侵袭浸润过程。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-8
引言  8-10
第一部分 AnnexinⅡ蛋白的原核表达、纯化及抗体制备  10-24
  材料和方法  10-15
  结果  15-21
  讨论  21-22
  参考文献  22-24
第二部分 AnnexinⅡ基因在急性白血病患者中的表达差异研究  24-34
  研究对象与方法  24-26
  结果  26-30
  讨论  30-32
  参考文献  32-34
结论  34-35
综述：AnnexinⅡ在肿瘤进展中的作用  35-44
研究生期间完成及待发表的论文  44-45
附录: 中英文对照缩略词表  45-46
致谢  46

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