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长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核、真核表达及其结构的预测

作　者: 王路
导　师: 刘光远；贾宁
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂-2 原核表达真核表达结构预测
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国流行最广泛和最重要的蜱种之一,主要叮咬牛、羊以及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体、以及衣原体等多种病原重要的传播媒介,主要影响家畜的生产性能,为畜牧业的发展造成极为严重的危害。在众多蜱的防控方法中,免疫学防制是前景最诱人的方法之一。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor,serpin)是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂,参与血凝、纤维蛋白溶解、补体激活、炎症反应及肿瘤抑制过程。广泛存在于动物、植物、病毒和细菌等各种生物中。蜱中的serpin与血液凝固、细胞因子激活等相关的宿主防御反应有关,用蜱的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂免疫宿主,能明显地削弱蜱传播病原的能力,而长角血蜱中的丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于血淋巴中,研究证明是一种“隐藏抗原”,是抗蜱疫苗候选抗原分子。同时该基因具有抗纤维蛋白酶活性,可能与血淋巴内的血液凝固调节有关。本研究根据GenBank中长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂(Haemaphysalis longicornis serine proteinase inhibitor -2, HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿[0]成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1164 bp的HLS2 DNA片段。将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化E. coli JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E. coli BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析。优化表达条件并大量表达后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性。结果表明:获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2 (序列号AB162827)序列的同源性为98%;构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了大小约为47KDa的HLS2融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7h后融合蛋白的表达量最高;Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应。将前述扩增获得到长角血蜱HLS2基因,与酵母表达载体pPIC9k连接,构建真核表达载体pPIC9K-HLS2,用SalⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化毕赤酵母GS115,在MD平板上挑取重组克隆,经G418抗性筛选重组菌株,并用甲醇诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting对培养物上清进行分析。结果表明:成功构建了HLS2毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-HLS2;经G418抗性梯度筛选获得了高拷贝菌株;电泳分析表明,培养上清中出现了与预测分子大小一致的49KDa左右的目的蛋白,且具有良好的免疫活性。本研究获得的大量HLS2蛋白,解决了抗蜱疫苗的抗原来源问题,为抗长角血蜱疫苗的深入研究奠定了基础。运用DNAStar分子生物学软件,对HLS2蛋白的二级结构及其抗原表位进行了识别分析和预测,结果表明HLS2编码蛋白有较高的抗原指数、较多的抗原表位,这与HLS2编码蛋白具有良好的抗原性相一致;HLS2编码蛋白的N-糖基化位点分析表明,含有三个潜在的N-糖基化位点;为深入研究HLS2编码蛋白的结构和功能提供理论参考,也为以抗原表位为基础的疫苗设计提供指导和借鉴。

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-9
第一章文献综述  9-24
  1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的概述  9-10
  2 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的分布  10-18
    2.1 寄生虫中的丝氨酸蛋白酶抑制剂  10-15
    2.2 其他物种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂  15-18
  3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与功能  18-21
  4 丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机理  21-22
  5 丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用前景  22-24
第二章长角血蜱 HLS2 基因原核表达载体的构建及表达  24-46
  前言  24
  1 材料和方法  24-38
    1.1 实验材料  24-26
      1.1.1 实验动物及蜱  24-25
      1.1.2 菌种、载体  25
      1.1.3 酶和主要试剂  25
      1.1.4 主要仪器、设备  25-26
    1.2 实验方法  26-38
      1.2.1 表达引物的设计  26
      1.2.2 长角血蜱总RNA 的提取  26-27
      1.2.3 RT-PCR 扩增  27-28
      1.2.4 RT- PCR 产物的回收与纯化  28-29
      1.2.5 目的片段与pET-30a(+)载体的酶切回收  29
      1.2.6 目的片段与表达载体的连接  29
      1.2.7 JM109 感受态细胞的制备  29-30
      1.2.8 连接产物的转化  30
      1.2.9 重组质粒的提取与鉴定  30-32
      1.2.10 表达菌株的获得  32
      1.2.11 重组质粒的诱导表达  32
      1.2.12 表达产物的SDS-PAGE 检测  32-36
      1.2.13 融合蛋白表达形式的鉴定  36
      1.2.14 重组蛋白的纯化  36-37
      1.2.15 表达产物的Western-blotting 检测  37-38
  2 结果  38-43
    2.1 长角血蜱总RNA 检测结果  38-39
    2.2 目的基因 HLS2 的 RT-PCR 扩增结果  39
    2.3 重组表达质粒 pET-30a-HLS2 的鉴定  39
    2.4 重组质粒的测序结果及序列分析  39-41
    2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析  41-43
    2.6 Western blotting 分析  43
  3 讨论  43-46
第三章长角血蜱 HLS2 在毕赤酵母中的表达  46-61
  前言  46
  1 材料和方法  46-53
    1.1 实验材料  46-48
      1.1.1 蜱种、菌种和载体  46
      1.1.2 酶和主要试剂  46-47
      1.1.3 培养基和溶液  47
      1.1.4 主要仪器、设备  47-48
    1.2 实验方法  48-53
      1.2.1 酵母表达载体的构建  48-51
      1.2.2 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的线性化  51
      1.2.3 毕赤酵母感受态细胞的制备  51
      1.2.4 电转化  51
      1.2.5 重组酵母菌株的筛选鉴定  51-52
      1.2.6 重组菌株的诱导表达  52
      1.2.7 表达产物的SDS-PAGE 分析  52
      1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测  52-53
  2 结果  53-58
    2.1 HLS2 基因的 PCR 扩增  53
    2.2 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的构建及鉴定  53-55
      2.2.1 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的构建  53
      2.2.2 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的鉴定  53-55
    2.3 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的线性化  55
    2.4 重组酵母菌株的筛选鉴定  55-56
      2.4.1 影印接种法筛选G418 抗性菌株结果  55
      2.4.2 重组酵母菌株的PCR 鉴定结果  55-56
    2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析  56-57
    2.6 表达产物的Western-blotting 检测  57-58
  3 讨论  58-61
第四章 HLS2 基因编码蛋白的结构预测  61-68
  前言  61
  1 材料和方法  61-62
    1.1 材料  61
    1.2 方法  61-62
  2 结果  62-66
    2.1 长角血蜱 HLS2 基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列  62-63
    2.2 HLS2 基因编码蛋白二级结构和淋巴细胞表位的预测  63-64
      2.2.1 HLS2 基因编码蛋白二级结构的预测  63
      2.2.2 HLS2 基因编码蛋白抗原特异性淋巴细胞抗原表位的预测  63-64
    2.3 HLS2 基因编码蛋白糖基化位点的预测  64-66
  3 讨论  66-68
第五章全文结论  68-69
致谢  69-70
参考文献  70-78
作者简介  78-79
导师简介  79-80

长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核、真核表达及其结构的预测

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