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猪源脑心肌炎病毒GXLC株致病性研究

作　者: 陈宏备
导　师: 郑喜邦；施开创
学　校: 广西大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 脑心肌炎病毒猪致病性 TaqMan荧光定量PCR 细胞因子
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)可以引起以仔猪急性脑炎、心肌炎及母猪繁殖障碍为特征的传染性疾病。EMCV可以感染小鼠,导致心肌炎、脑炎、糖尿病等。本研究通过将猪源EMCV GXLC株感染小鼠和断乳仔猪,来分析该病毒的致病性。根据发表在GenBank EMCV保守序列3D基因、小鼠和猪促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS及管家基因β-actin,分别设计特异性引物和探针,构建含有各自目的基因序列的重组质粒作为阳性标准品,建立相应的TaqMan real-time PCR检测方法。用标准品所构建的标准曲线相关系数(R2)达到0.998以上；可以检测到标准品下限浓度为1×101 copies/μL;与FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和BHK-21细胞所获得的DNA或cDNA为模板无交叉反应。检测促炎细胞因子和管家基因时,只有每种因子的质粒标准品和反转录获得的cDNA呈现阳性反应；组内与组间试验的变异系数均在2%以下。上述试验结果证明,我们建立的TaqMan real-time PCR方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于EMCV、小鼠及猪的细胞因子的检测和定量分析。为研究猪源EMCV GXLC株对小鼠和仔猪的致病性,将其接种4周龄健康BALB/c小鼠和断乳仔猪。观察临床症状,观察大体病理变化及组织病理变化,检测心、脑、脾组织病毒含量,检测心、脑、脾组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA水平,并测定小鼠心脏／体重比值和血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量,同时检测猪血清抗体滴度。结果表明：(1)感染小鼠表现出明显的神经症状,多数小鼠在出现症状后24 h内死亡；仔猪感染后,体温升高,表现出明显精神萎靡等症状。(2)剖检小鼠发现心脏有明显的白色坏死灶,脑出血；仔猪发现心脏膨大、心肌变软,脑充血,淋巴结肿大、充血。(3)感染小鼠的心重/体重比值显著升高,血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量升高；猪血清中可检测到高滴度的抗EMCV抗体。(4)感染小鼠和仔猪脑、心、脾、血清中检测到大量病毒,并且其含量与临床症状、病理损害等密切相关。(5)小鼠和仔猪组织病理学观察发现,脑组织神经细胞变性、坏死,大脑皮层微血管有出血和炎性细胞浸润,心脏组织大面积心肌细胞坏死、组织降解、萎缩和弥漫性炎症；组织病理变化的评分值显著升高。(6)感染小鼠和仔猪的心、脑、脾组织中IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表达水平显著上调,而且细胞因子表达的高峰期与出现典型临床症状、病理变化时期相一致。总而言之,猪源EMCV GXLC株对小鼠和仔猪明显致病性,而IL-1p、TNF-α、IL-6、iNOS等细胞因子在EMCV对小鼠的致病过程中发挥重要作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
缩略词表  9-12
第一章文献综述  12-18
  1.1 EMCV基因组结构  12-13
  1.2 EMCV的流行特点  13
  1.3 EMCV的致病性  13-15
    1.3.1 EMCV对鼠的致病性  13-14
    1.3.2 EMCV对灵长类动物的致病性  14
    1.3.3 EMCV对猪的致病性  14-15
  1.4 EMCV致病性机理研究  15-16
  1.5 诊断方法  16-17
    1.5.1 病毒分离  16
    1.5.2 抗体检测方法  16
    1.5.3 病原学检测方法  16-17
  1.6 研究目的与意义  17-18
    1.6.1 目的  17
    1.6.2 意义  17-18
第二章猪源脑心肌炎病毒、小鼠和猪细胞因子TaqMan real-time PCR检测方法的建立  18-36
  2.1 材料  18-21
    2.1.1 病毒和实验动物  18-19
    2.1.2 主要试剂  19
    2.1.3 引物和探针  19-21
  2.2 方法  21-23
    2.2.1 重组质粒标准品的制备  21-22
    2.2.2 TaqMan real-time PCR条件最优化  22
    2.2.3 TaqMan real-time PCR标准曲线的制作  22
    2.2.4 TaqMan real-time PCR的敏感性试验  22
    2.2.5 TaqMan real-time PCR的特异性试验  22-23
    2.2.6 TaqMan real-time PCR的重复性试验  23
  2.3 结果  23-34
    2.3.1 质粒标准品的制备  23-25
    2.3.2 TaqMan real-time PCR条件最优化  25
    2.3.3 TaqMan real-time PCR标准曲线的制作  25-28
    2.3.4 TaqMan real-time PCR的敏感性试验  28-30
    2.3.5 TaqMan real-time PCR的特异性试验  30-32
    2.3.6 TaqMan real-time PCR的重复性试验  32-34
  2.4 讨论  34-36
第三章猪源EMCV GXLC株对小鼠和仔猪致病性研究  36-59
  3.1 方法  36-39
    3.1.1 EMCV GXLC株TCID_(50)的测定  36
    3.1.2 EMCV GXLC株LD_(50)的测定  36-37
    3.1.3 小鼠存活曲线的测定  37
    3.1.4 小鼠攻毒试验  37
    3.1.5 断乳仔猪攻毒试验  37
    3.1.6 小鼠心脏/体重比值的测定  37-38
    3.1.7 猪肛拭子和鼻拭子病毒检测  38
    3.1.8 组织器官(心和脑)病理组织学观察  38
    3.1.9 组织器官病毒含量的测定  38-39
    3.1.10 血清病毒含量的测定  39
    3.1.11 小鼠血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量的检测  39
    3.1.12 猪血清中和试验  39
    3.1.13 小鼠和猪细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表达水平的测定  39
  3.2 结果  39-55
    3.2.1 EMCV GXLC株TCID_(50)测定结果  39-40
    3.2.2 EMCV GXLC株LD_(50)测定结果  40
    3.2.3 小鼠存活曲线测定结果  40
    3.2.4 猪体温测量结果  40-41
    3.2.5 猪肛拭子和鼻拭子病毒检测结果  41
    3.2.6 临床症状和剖检病变观察  41-42
    3.2.7 小鼠心脏/体重比值测定结果  42-43
    3.2.8 组织器官(心和脑)组织病理学观察结果  43-45
    3.2.9 组织器官中病毒含量测定结果  45-47
    3.2.10 血清中病毒含量测定结果  47-48
    3.2.11 小鼠血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量的测定结果  48
    3.2.12 中和抗体效价检测结果  48-49
    3.2.13 组织器官中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表达水平测定结果  49-55
  3.3 讨论  55-59
    3.3.1 猪源EMCV GXLC株对小鼠的致病性研究  55-57
    3.3.2 猪源EMCV GXLC株对仔猪的致病性研究  57-59
4 结论  59-60
参考文献  60-65
附录1  65-66
附录2  66-67
致谢  67-68
攻读学位期间发表论文情况  68

猪源脑心肌炎病毒GXLC株致病性研究

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