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桃小食心虫病原真菌的致病性及其胞外酶的作用研究

作　者: 朱永敏
导　师: 薛皎亮
学　校: 山西大学
专　业: 动物学
关键词: 桃小食心虫病原真菌形态鉴定致病性胞外酶
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

桃小食心虫是我国北方地区危害最大的一种果树食心虫类害虫。以往的化学杀虫剂防治对具有入土和蛀果危害习性的桃小食心虫幼虫起不到防治效果,利用昆虫病原真菌感染致死昆虫成为桃小食心虫防治新技术研究的重要领域。为了筛选对桃小食心虫具有高毒力的菌株,本文从自然染病的桃小食心虫虫体上分离出致病菌,进行划线分离、形态鉴定、致病力比较和侵染特性的研究,为桃小食心虫的生物防治筛选出高毒力病原菌株,并对真菌的应用提供理论依据。内容包括(1)桃小食心虫自然染病虫尸上病原真菌的分离及形态鉴定；(2)病原菌株致病力和对北方低温低湿环境适应性比较；(3)病原菌侵染桃小食心虫过程中胞外酶和海藻糖酶的作用。结果如下：(1)从自然染病桃小食心虫虫尸上分离出5株真菌,分别编号为TSL01、TSL02、TSL03、TSL04和TST05,通过回接试验证明这5株菌株为桃小食心虫的病原菌。其培养性状和显微形态特征如下：菌株TSL01、TSL03和TSL04均为白色菌丝,菌落较大,菌丝较稀疏,分生孢子既有大孢子又有小孢子,大孢子月牙形或镰刀形,具有隔,小孢子肾形、卵圆形或椭圆形,单生或假头状着生,菌丝透明有隔,轮状生长；菌株TSL02菌落小,后期产生黄色色素,分生孢子圆柱形至梭形,串生,分生孢子梗呈“Y”形；菌株TST05菌落较小,菌丝初期为白色,后期为黄色,产生浓密的黄色孢子粉,分生孢子球形,以球形的分生孢子头形成孢子,分生孢子梗成筒形。据此鉴定菌株TSL01、TSL03和TSL04属于镰孢属尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum),菌株TSL02属于拟青霉属粉质拟青霉(Paecilomyces farinosus),菌株TST05为白僵菌属球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。其中尖孢镰孢菌和粉质拟青霉是寄生桃小食心虫新的病原菌种。(2)测定了5株真菌(球孢白僵菌BbTST05,粉质拟青霉PfTSL02,尖孢镰孢菌FoTSL01, FoTSL03, FoTSL04)对寄主的感染致死率、产孢量、孢子萌发率、抗紫外线能力、胞外类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的活性,比较了生物学特性和致病力。结果显示,球孢白僵菌BbTST05和粉质拟青霉PfTSL02对桃小食心虫致死率最高,在10d内桃小食心虫死亡率分别为89.28%和72.22%,LT50最小,分别为5.49d和7.09d；两菌株在各个温、湿度条件下产孢量和萌发率也最高,产孢量比尖孢镰孢菌3个菌株的高6-11倍,萌发率达到93%以上；在15℃和RH30%的低温低湿条件下,二菌株的产孢量和萌发率仍很高,其中BbTST05产孢量为1.93×108个/cm2,PfTSL02的为1.63×108个/cm2,两菌株的孢子萌发率都达到30%以上；两菌株的菌落生长受紫外线照射的影响非常小,说明它们抗紫外线能力强。为了评价这5个菌株的致病力,本研究比较了它们分泌胞外酶的能力。在5个菌株中,菌株BbTST05的类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶活性最大,活性高峰也出现的最早,菌株PfTSL02的3种胞外酶活性仅次于BbTST05菌株。类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的活性与桃小食心虫死亡率呈正相关关系,相关系数分别为0.9213,0.8922,0.8016。本研究为桃小食心虫生物防治筛选了两个高效致病菌株,即球孢白僵菌和粉质拟青霉。(3)球孢白僵菌BbTST05菌株接种到桃小食心虫表皮培养基上,结果发现类枯草杆菌蛋白酶在前3d酶活性持续增长并处于较高水平,在第3d达到最大值12.43±0.69U/g,然后开始下降；几丁质酶活性在前3d快速增长,3d后增长放缓,持续上升到第8d达到最大值1.467±0.108U/g。说明类枯草杆菌蛋白酶在菌丝侵染表皮的前期发挥了作用,降解表皮中的蛋白质,使几丁质暴露,诱导几丁质酶的产生以分解表皮的几丁质。脂肪酶活性在前6d持续上升,达到最大值2.654±0.163U/g,然后降低。说明脂肪酶在菌丝入侵虫体体壁的前期对蜡层的分解能力持续上升,在后期作用较小。球孢白僵菌BbTST05接种到桃小食心虫虫体培养基上连续培养6d,结果发现虫体的海藻糖含量随着培养天数的增加逐渐减少,前3d的下降幅度达72.9%；与其相对应,菌株分泌的海藻糖酶活性在前2d活性较高,第2d达到最大值3.622±0.185mU/mg,然后开始降低,后期酶活性维持在一个较低水平。说明真菌入侵桃小食心虫虫体过程中,大量分泌海藻糖酶,降解虫体内的海藻糖为真菌提供营养碳源。由此,从胞外酶和海藻糖酶的角度揭示了病原菌入侵桃小食心虫体壁和体腔的致病机理。

全文目录

中文摘要  11-13
ABSTRACT  13-16
第一章前言  16-24
  1.1 桃小食心虫的危害及生物防治  16-18
  1.2 昆虫病原真菌对昆虫的侵染过程和致病机理  18-22
    1.2.1 侵染过程  18
    1.2.2 病原真菌入侵寄主表皮过程中胞外酶的作用  18-21
      1.2.2.1 蛋白酶作用  19-20
      1.2.2.2 几丁质酶作用  20
      1.2.2.3 脂肪酶作用  20-21
    1.2.3 病原真菌入侵昆虫体腔过程中海藻糖酶的作用  21-22
  1.3 本文的研究内容、目的和意义  22-24
第二章桃小食心虫病原真菌的分离和形态鉴定  24-35
  2.1 材料与方法  24-25
    2.1.1 桃小食心虫自然染病虫尸  24
    2.1.2 培养基  24
    2.1.3 回接试验的虫源  24
    2.1.4 仪器和试剂  24
    2.1.5 病原真菌的分离和纯化  24-25
    2.1.6 菌株培养与形态观察  25
    2.1.7 菌种鉴定  25
    2.1.8 孢子悬浮液的制备  25
    2.1.9 桃小食心虫染菌试验  25
  2.2 结果与分析  25-33
    2.2.1 自然罹病虫尸症状  25-27
    2.2.2 菌株分离结果  27
    2.2.3 回接杀虫试验结果  27-28
    2.2.4 形态特征  28-33
      2.2.4.1 菌株TSL01  28-29
      2.2.4.2 菌株TSL02  29-30
      2.2.4.3 菌株TSL03  30-31
      2.2.4.4 菌株TSL04  31-32
      2.2.4.5 菌株TST05  32-33
  2.3 讨论  33-35
第三章桃小食心虫五株病原真菌的生物学特性与致病力研究  35-49
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 供试菌种和昆虫  35
    3.1.2 仪器和试剂  35
    3.1.3 孢子悬浮液的制备  35-36
    3.1.4 产孢量测定  36
    3.1.5 孢子萌发率测定  36
    3.1.6 抗紫外线能力测定  36
    3.1.7 菌种在桃小食心虫虫尸液体培养基上的培养和酶液的制备  36
    3.1.8 类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)、几丁质酶和脂肪酶的活性测定方法  36-37
    3.1.9 五株菌株对桃小食心虫染菌及致死率测定  37
  3.2 结果与分析  37-46
    3.2.1 不同菌株感染桃小食心虫的症状和致死率  37-40
      3.2.1.1 感染症状  37-39
      3.2.1.2 致死率比较  39-40
    3.2.2 温湿度和紫外线照射对菌株产孢量和孢子萌发率的影响  40-43
      3.2.2.1 产孢量比较  40
      3.2.2.2 孢子萌发率比较  40-41
      3.2.2.3 抗紫外线能力比较  41-43
    3.2.3 与菌株毒力相关的3种胞外酶活性的变化趋势及比较  43-46
      3.2.3.1 五菌株类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)活性变化趋势及比较  43-44
      3.2.3.2 五菌株几丁质酶活性变化趋势及比较  44
      3.2.3.3 五菌株脂肪酶活性变化趋势及比较  44-45
      3.2.3.4 菌株胞外酶与桃小食心虫致死率的相关性  45-46
  3.3 讨论  46-49
第四章球孢白僵菌侵染桃小食心虫过程中胞外酶和海藻糖酶的作用研究  49-57
  4.1 材料和方法  49-50
    4.1.1 菌株和桃小食心虫幼虫  49
    4.1.2 主要仪器和试剂  49
    4.1.3 菌株分生孢子悬浮液制备  49
    4.1.4 菌株培养与酶液制备  49
    4.1.5 类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶活性测定  49-50
    4.1.6 海藻糖含量测定  50
    4.1.7 海藻糖酶活性测定  50
    4.1.8 桃小食心虫表皮结构观察  50
  4.2 结果与分析  50-54
    4.2.1 桃小食心虫表皮结构  50-51
    4.2.2 球孢白僵菌三种胞外酶在桃小食心虫表皮培养基上的活性变化趋势  51
    4.2.3 三种胞外酶与桃小食心虫体壁组成之间的相互关系  51-52
    4.2.4 海藻糖酶活性和海藻糖含量的变化趋势  52-54
    4.2.5 菌的海藻糖酶活性和虫体海藻糖含量之间的相互关系  54
  4.4 讨论  54-57
第五章总结  57-60
参考文献  60-67
发表文章目录  67-68
致谢  68-69
个人简况及联系方式  69-71

桃小食心虫病原真菌的致病性及其胞外酶的作用研究

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