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Rab7负向调控巨噬细胞中TLR3/4信号转导通路的研究

作　者: 王宁飞
导　师: 王玉珍
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: TLR3 TLR4 Poly I:C LPS Rab7
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Toll样受体家族可以识别几乎所有的病原微生物的一些结构组分和代谢产物,通过信号转导通路诱发细胞因子和趋化因子等启动机体的天然免疫,构成了机体抵抗病原微生物的第一道防线,在免疫学研究中一直是一个很受关注的家族。TLRs的活化是一把双刃剑。一方面TLRs的活化在启动天然免疫应答和适应性免疫应答中发挥重要作用,另外一方面过渡活化或者活化异常可能引起急慢性疾病。因此TLR信号转导通路的负相调控成为天然免疫研究中的热点问题。目的:本实验通过建立稳定表达Rab7及其突变体的巨噬细胞系,分析稳定表达细胞系的生物学特性,研究Rab7及其突变体基因过表达后对LPS和Poly I:C刺激的巨噬细胞表达细胞因子的影响。方法:将Rab7及其突变体Rab7(T22N)的真核表达载体通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418选择性培养基筛选,建立稳定表达Rab7及Rab7T22N的细胞系。通过RT-PCR和Western Blot方法鉴定稳定表达细胞系。通过观察细胞形态及MTT法分析稳定表达细胞系的生长特性。以LPS和Poly I:C刺激稳定表达细胞系不同时间后检测细胞因子的表达量变化。结果:与转染空质粒的细胞相比,转染Rab7和Rab7T22N的细胞中Rab7的mRNA和蛋白水平都显著增高。Rab7过表达后引起细胞形态变化并显著抑制了细胞增殖,Rab7T22N过表达后促进细胞增殖。Rab7过表达后,巨噬细胞在LPS和Poly I:C刺激后分泌的细胞因子显著降低,而Rab7T22N过表达后其的分泌又恢复。结论:成功建立了稳定表达Rab7及其突变体的细胞系。Rab7过表达后抑制了细胞增殖,负向调控了TLR信号通路。该研究为进一步阐明Rab7在TLRs信号通路中的作用奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 引言  9-15
  1.1 Toll 家族背景介绍  9-12
    1.1.1 TLR 信号转导  9-10
    1.1.2 TLR 信号与疾病的关系  10
    1.1.3 TLR3、TLR4 简介及关联  10-11
    1.1.4 TLR3、4 配体介绍  11-12
  1.2 Rab 家族背景介绍  12-13
    1.2.1 Rab5、7、9 的简介  13
  1.3 研究意义  13-15
    1.3.1 Poly I:C/TLR3 信号通路过渡活化  13-14
    1.3.2 LPS/TLR4 信号通路过渡活化  14-15
    1.3.3 研究目的  15
2 Rab7 诱导表达模式的研究  15-23
  2.1 材料  16-17
    2.1.1 实验材料及试剂  16
    2.1.2 仪器  16
    2.1.3 试剂配置  16
    2.1.4 引物  16-17
  2.2 实验方法  17-19
    2.2.1 小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 的培养  17
    2.2.2 细胞总 RNA 的提取及反转录  17
    2.2.3 cDNA 的制备  17-18
    2.2.4 PCR 反应体系  18-19
    2.2.5 LPS 和poly I:C 刺激后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表达时效关系研究  19
  2.3 结果分析  19-22
    2.3.1 RAW 264.7 细胞的培养及刺激  19-20
    2.3.2 LPS 刺激 RAW264.7 细胞后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表达时-效关系研究  20
    2.3.3 Poly I:C 刺激 RAW264.7 细胞后 Rab5a、Rab7、Rab9 的mRNA 水平表达时-效关系研究  20-21
    2.3.4 RTQ-PCR 检测 Rab7 的mRNA 水平表达时效关系研究  21-22
  2.4 讨论  22-23
3 Rab7 调节巨噬细胞 Toll 样受体信号转导通路的研究  23-40
  3.1 材料与方法  23-28
    3.1.1 细胞株和主要试剂  23
    3.1.2 试剂配置  23-24
      3.1.2.1 配制聚丙烯酰电泳的试剂  23-24
      3.1.2.2 转膜的试剂  24
    3.1.3 引物  24-25
    3.1.4 实验步骤  25-28
      3.1.4.1 RAW264.7 巨噬细胞的培养  25
      3.1.4.2 细胞计数  25
      3.1.4.3 突变载体的构建  25
      3.1.4.4 细胞转染  25
      3.1.4.5 蛋白提取  25-26
      3.1.4.6 BCA 检测检测蛋白浓度  26
      3.1.4.7 SDS-PAGE  26
      3.1.4.8 Western blotting  26-28
      3.1.4.9 NO、iNOS 含量测定  28
      3.1.4.10 MTT 法测基因转染对 RAW264.7 细胞的影响  28
  3.2 结果分析  28-38
    3.2.1 Rab7 突变体稳定表达的细胞株的鉴定  28-29
    3.2.2 稳定转染细胞 RAW264.7 生长形态  29-30
    3.2.3 Rab7 抑制 Poly I:C 诱导的巨噬细胞中 TNF-α、IL-1β的表达  30-32
    3.2.4 Rab7 抑制 Poly I:C 诱导的巨噬细胞中 IP-10、IFN-β的表达  32-34
    3.2.5 Poly I:C 诱导的巨噬细胞中 NO/iNOs 的表达  34-35
    3.2.6 Rab7 抑制 LPS 诱导的巨噬细胞中 IP-10、IFN-β的表达  35-37
    3.2.7 Rab7 在 LPS 介导的 TLR4 通路中的作用  37-38
  3.3 讨论  38-40
4 结论  40
5 展望  40-41
致谢  41-42
参考文献  42-47
作者简介  47

Rab7负向调控巨噬细胞中TLR3/4信号转导通路的研究

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