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禾谷镰刀菌FgRab7功能及其调控网络初探

作　者: 邓小龙
导　师: 王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 禾谷镰刀菌 Rab7 Pull-down Real-time PCR 蛋白组学
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
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内容摘要

禾谷镰刀菌是引起小麦、玉米等病害主要病原菌，由该病原菌侵染引起的减产和真菌毒素污染不仅影响小麦等农产品品质还对食品及饲料的安全构成威胁，因而在农业生产上备受关注。目前，对该病原菌的研究热点逐渐转向发现新药物作用靶点和弄清其致病机理等方面。功能基因的研究是探索药物靶点的重要途径，本研究从具有分子开关作用的Ras家族中的Rab7基因的敲除入手，目的在于初步了解该基因在禾谷镰刀菌中的分子、细胞等水平的生物学功能，从而进一步了解该分子在菌丝生长、致病性、产孢、产毒素等方面的作用。结果发现，Rab7的敲除影响菌丝生长速度、毒素产量和产孢量。为进一步明确Rab7调控产孢和生长的机制，一方面，我们利用Hjs P u11一down的方法筛选与FgRab7直接互作的蛋白，并运用生物信息学方法与酵母数据库进行比对分忻。结果获得了一个可能跟DON毒素降解相关的酶(15—O一acetyltransferase_rri3)和两个与孢子形成相关的蛋白。另一方面，我们对野生型和敲除突变体进行了蛋白组学分忻，结果显示，FgRab7的敲除对100多种蛋白产生影响，我们选取其中差异在三倍以上的43个蛋白点进行了质谱分忻，并随机抽取了其中的8个蛋白进行了转录水平的：Real—time PCR检测，发现这些基因的表达水平与蛋白水平一致。因此，我们认为FgRab7不仅调控孢子的形成、营养菌丝的生长，还参与DON毒素的合成分泌、代谢酶的表达。这为阐明Rab家族蛋白调控镰刀菌生长发育以及产孢机制，同时进一步为制定更加有效合理的赤霉病治理策略和措施奠定理论基础。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
1 引言  9-17
  1.1 镰刀菌与禾谷镰刀菌  9-11
  1.2 Ras超家族蛋白  11-12
  1.3 研究真核生物Rab家族蛋白的重要意义  12-15
    1.3.1 Rab家族概述  12-14
    1.3.2 Rab蛋白介导的调节网络研究  14-15
  1.4 Rab5／Rab7在胞吞过程中的功能相关性  15-16
  1.5 禾谷镰刀菌致病机制以及产毒素机理的研究需要新的突破口  16-17
2 材料与方法  17-33
  2.1 实验材料  17-18
    2.1.1 供试菌株  17
    2.1.2 行使用的培养基  17
    2.1.3 生化试剂及有关溶液  17-18
    2.1.4 各类抗生素  18
    2.1.5 仪器  18
  2.2 实验方法  18-33
    2.2.1 FgRab7 DNA序列获得  18
    2.2.2 FgRab7 与酿酒酵母YPT7的同源性和三级结构予页测  18-19
    2.2.3 谷镰刀菌基因组DNA提取  19
    2.2.4 谷镰刀菌Rab7基因敲除突变体的载体构建  19-20
    2.2.5 禾谷镰刀菌原生质体制备与转化  20-21
    2.2.6 禾谷镰刀菌菌丝t’totalRNA的提取及检测  21
    2.2.7 RT-PCR反转录  21-22
    2.2.8 菌落生长速度测定  22
    2.2.9 产孢量统计  22
    2.2.10 总蛋白的提耳(TCA／N酮法)及定量检测(Bradlbrd法)  22-23
    2.2.11 ZXRab7突变体总蛋白双向电泳  23-25
    2.2.12 Rab7基因PCR扩增条件  25-26
    2.2.13 TA克隆  26
    2.2.14 Escherichia coli DH5a毒受态细胞的制备和转化  26-27
    2.2.15 Escherichia coli BL21毒受态细胞的制备和转化  27-28
    2.2.16 质粒的提取  28
    2.2.17 pET28a-Rab7表达载体构建  28-29
    2.2.18 FgRab7的诱导表达  29-30
    2.2.19 His-Rab7纯化  30-31
    2.2.20 His-Rab7 Pull-down 分析  31-32
    2.2.21 Elisa法测定野生型与缺夫突变体禾谷镰刀菌DON毒素  32-33
3 结果与分析  33-47
  3.1 禾谷镰刀菌FgRab7基因克隆  33
  3.2 禾谷镰刀菌FgRab7与酵母菌YPT7结构对比分析  33-34
  3.3 FgRab7的功能分忻  34-40
    3.3.1 敲除载体的构建  34-35
    3.3.2 敲除突变体验证  35-36
    3.3.3 敲除突变体的表型分忻  36-40
      3.3.3.1 敲除突变体生长速率明显下降而且菌丝形态也有明显变化  36-37
      3.3.3.2 Rab7敲除突变体产孢量明显下降  37-38
      3.3.3.3 敲除突变体GFP 融合互补及定位  38-39
      3.3.3.4 FgRab7敲除影ⅡDON毒素的产生  39-40
  3.4 敲除突变体的蛋白组学分忻  40-44
    3.4.1 蛋白质的差异表达分忻  41-44
  3.5 His-Rab7 pull-down 分析  44-47
4 小结与讨论  47-51
  4.1禾谷镰刀菌中FgRab7影响产孢、生长、和DON毒素分泌量  47
  4.2 FgRab7与其他蛋白互作的初探  47-48
  4.3 Rab7-GFP定位  48-49
  4.4 利用双向电泳技术研究Rab7缺失突变对其他蛋白的影响  49-51
参考文献  51-57
附录  57-63
致谢  63

禾谷镰刀菌FgRab7功能及其调控网络初探

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