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伴与不伴脂肪细胞共培养状态下TNF-α对人单核/巨噬细胞TLR4及其信号通路的影响

作　者: 沈海军
导　师: 马向华；沈捷
学　校: 南京医科大学
专　业: 内分泌与代谢病
关键词: 肥胖炎症 TNF-α TLR4 人单核/巨噬细胞细胞系THP-1 人原代脂肪细胞细胞
分类号: R589.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景与目的:近年来,肥胖已成为世界关注的热门话题,在肥胖的发生机制的研究中,炎症学说是其重要进展之一,肥胖状态时脂肪组织中巨噬细胞的浸润增加,释放的炎症因子增多。本课题研究通过二部分实验观察伴与不伴脂肪细胞共培养状态下,TNF-α对人单核/巨噬细胞系THP-1细胞的TLR4受体表达和其下游炎症转导通路的影响,初步探讨了TLR4及其信号转导通路在炎症与肥胖关系中的可能作用及机制。方法:(1)用不同浓度TNF-α(0 ng/ml、0.1 ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)分别作用于人单核/巨噬细胞系THP-1细胞12小时,24小时,48小时,通过倒置相差显微镜动态形态学大体观、CCK8(Cell Counting Kit-8)比色法观察TNF-α对THP-1细胞增殖效应的影响。(2)用上述不同浓度TNF-α分别干预THP-1细胞生长24小时,流式细胞仪技术检测THP-1细胞表面TLR4受体表达情况;提取细胞的总RNA,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其TLR4、Myd88的mRNA表达水平。(3)取人大网膜来源的前脂肪细胞进行原代培养和诱导分化后,通过Transwell小室,建立与单核/巨噬细胞THP-1的共培养体系,用流式细胞仪技术分别检测单独培养的单核/巨噬细胞组、脂肪细胞和单核细胞共培养组、用10ng/ml TNF-α干预(24小时)的共培养组,以及JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂PD98059和P38抑制剂SB203580分别干预共培养体系一小时后再加10ng/ml TNF-α干预24小时的各组单核巨噬细胞系THP-1细胞表面TLR4的表达情况;并收集细胞培养的上清,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-6、抵抗素的水平。结果:(1)细胞形态学、CCK8比色法结果显示,各浓度TNF-α均能不同程度地促进THP-1细胞增殖,其中以10ng/ml干预24h组促细胞增殖的效应最显著(P<0.05)。(2)流式细胞仪检测结果显示TNF-α呈浓度依赖性诱导TLR4受体的激活表达,其中以10ng/ml组TLR4受体表达增加最显著(P<0.05);RT-PCR结果显示,与对照组相比,10ng/ml TNF-α作用于THP-1细胞24h后,可明显上调细胞TLR4、Myd88的mRNA表达水平,差异具有显著性(P均< 0.05)。(3)THP-1细胞与人原代脂肪细胞共培养后,THP-1细胞表面TLR4受体较单独培养组表达上调,予TNF-α干预的共培养体系,THP-1细胞TLR4受体表达进一步增高,而加入JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂PD98059和P38抑制剂SB203580后,与TNF-α干预的共培养组比较,TLR4受体表达下降(P<0.05)。(4)ELISA结果显示共培养组较细胞单独培养组IL-6表达上调(P<0.05),抵抗素表达无明显变化, TNF-α干预组较共培养组IL-6、抵抗素表达均明显上调(P<0.05),加用SP600125、SB203580干预组较TNF-α干预的共培养组IL-6、抵抗素表达下调(P<0.05),PD98059组两者均无明显变化。结论: TNF-α激活THP-1细胞TLR4及下游Myd88信号通路而对细胞产生影响。人原代脂肪细胞与单核巨噬细胞共培养促进TLR4的激活表达,TNF-α干预后,其表达进一步增高,而加用JNK、ERK和p38抑制剂后,这种升高的趋势有所降低,说明这种诱导TLR-4高表达的过程,与MAPK(JNK、ERK、P38)转导途径的激活有关,并影响下游炎症因子的释放。本课题揭示了TLR4及其信号转导通路在炎症与肥胖关系中的可能作用及机制,对症使用抗炎介质或选择阻断炎症介导的TLR4信号通路及其下游炎症转导通路的传导过程有望成为肥胖症预防、干预和治疗的新靶点,因此具有重要的理论和临床意义。

全文目录

英文缩写注释  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-10
引言  10-13
第一部分 TLR4 在 TNF-α 促人单核细胞系增殖中的机制研究  13-32
  摘要  13-14
  Abstract  14-15
  前言  15
  材料和方法  15-22
  结果  22-25
  讨论  25-28
  参考文献  28-32
第二部分 TLR4在人单核/巨噬细胞和人原代脂肪细胞共培养体系中的机制初探  32-47
  摘要  32-33
  Abstract  33-34
  前言  34-35
  材料和方法  35-40
  结果  40-42
  讨论  42-44
  参考文献  44-47
全文小结  47-48
综述脂毒性对胰岛细胞功能影响的研究进展  48-56
  参考文献  53-56
硕士期间发表论文情况  56-57
致谢  57

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