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海洋亚硫酸杆菌M44的鉴定及代谢产物研究

作　者: 龙聪
导　师: 焦炳华；刘小宇
学　校: 第二军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亚硫酸杆菌 16S rDNA序列分析分离纯化环二肽代谢产物细胞毒
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本课题采用的实验菌株M44是从中国东海（东经122.8o,北纬30.9o）海水中分离得到的一株低嗜盐菌,最适生长盐度为2.5%,经MTT法筛选表明,菌株M44发酵液对HL-60、HepG2、SW1990细胞株均有较强的细胞毒活性。对菌株M44产生的次生代谢产物的热及酸、碱稳定性研究结果表明,发酵液中活性物质对热反应比较稳定,90℃处理30 min后细胞毒活性基本不变,但发酵液在pH 3.0和pH 11.0条件下处理2 h后调回其原始pH,细胞毒活性基本丧失。通过抽提菌株M44的总DNA模板,PCR扩增16S rDNA序列,Blast比对并构建进化树,结果显示其与亚硫酸杆菌（Sulfitobacter dubius）的进化位置最为接近,它们的相似度高达99%。该菌革兰染色、培养特征、生长特性、部分生理生化特征、胞壁脂肪酸组分、基因组G+C %等研究也显示该菌株具有亚硫酸杆菌的特征,因此鉴定其为亚硫酸杆菌。在对菌株M44的发酵条件进行优化后,得到其最佳摇瓶发酵条件为:温度25℃、初始pH 7.0、装液量50 mL/250 mL、接种量4 %。在此条件下培养的发酵液其细胞毒活性最强。小量发酵后的发酵液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取,分别测定其对HL-60、HepG2、SW1990细胞株的细胞毒活性,结果发现活性成分分布在乙酸乙酯萃取部分中,为中等极性物质。摇瓶大规模发酵得菌液60 L,离心除菌体后,上清用等体积乙酸乙酯充分萃取三次,减压蒸干,最后得到乙酸乙酯浸膏5 g。通过ODS C-18柱层析、Sephadex LH-20凝胶层析以及RP-HPLC等各种色谱技术,对M44产生的次生代谢产物进行分离纯化,共得到了25个单体化合物。利用¹H-NMR、¹³C-NMR、EI-MS、等波谱技术并结合化合物的理化性质确定了其中6个化合物的结构。它们分别是:分别为Ⅰ、环（缬氨酸-亮氨酸）;Ⅱ、环（苯丙-缬氨酸）;Ⅲ、环（苯丙-亮氨酸）;Ⅳ、环（亮-异亮氨酸）;Ⅴ、环（苯丙-异亮氨酸）;Ⅵ、环（色-脯氨酸）。化合物的结构如下:化合物的活性测定结果表明:环（亮-异亮氨酸）对HepG2和Hep2细胞株均表现出一定的细胞毒活性,其IC₅₀分别为118μg/mL和135μg/mL,其余各单体化合物对4种肿瘤细胞株的细胞毒活性均不明显;分离得到的化合物对大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌的抗菌活性均不明显,且对菌株M44产生代谢产物的影响也不明显。综上所述,本工作主要针对海洋亚硫酸杆菌M44及其生物活性物质进行了初步的研究,并分离得到了6个环二肽结构,为深入开发东海微生物资源奠定了一定的工作基础。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
缩略词表  9-10
前言  10-14
第一部分活性菌株的筛选  14-20
第二部分菌株M44 的多相分类学鉴定  20-39
第三部分菌株M44 发酵条件的初步优化  39-45
第四部分菌株M44 代谢产物的分离纯化及生物学活性评价  45-56
结论  56-57
附录一论文中用到的溶液、培养基、显色剂配方  57-60
附录二各化合物谱图  60-67
文献综述  67-76
  参考文献  74-76
参考文献  76-79
撰写论文及科研工作  79-80
致谢  80-81

海洋亚硫酸杆菌M44的鉴定及代谢产物研究

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