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蛔虫过敏原的改良构建及在过敏性鼻炎发病机制中的研究

作　者: 于超生
导　师: 文忠；陶爱林
学　校: 南方医科大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: 蛔虫 过敏原 ABA-1 密码子优化 过敏性鼻炎
分类号: R765.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


蛔虫是人体常见寄生虫,蛔虫感染人体后可以引起许多疾病,其中过敏性疾病是其中的常见疾病,蛔虫可以通过分泌过敏原的方式直接致敏机体,引起蛔虫过敏性疾病。在蛔虫的过敏原中,ABA-1蛋白(Ascaris body fluid allergen 1)是一种重要的过敏原,它是一类蛋白的总称,有A和B两类蛋白组成,其中A类蛋白有A4、A3、A2、A1四种组成,而B类蛋白只有B1一种。在蛔虫过敏性疾病的治疗中,脱敏治疗被认为是一种可以从病因学方面进行治疗的有效方法,脱敏治疗需要有较高纯度的脱敏制剂和完整的抗原表位,在国内的许多研究中对于蛔虫过敏原的研究主要采用蛔虫粗提液的方法,这就增加了脱敏治疗的危险性,而在国外的研究中主要采用ABA-1蛋白中的主要蛋白ABA-1A1,而忽略了其他蛋白的作用；另一方面,蛔虫还可以通过免疫调节的方法,改变机体的免疫平衡方向,使机体更易患过敏性疾病。蛔虫感染人体后,有一部分可以刺激机体产生蛔虫抗体,大量研究证明哮喘与蛔虫抗体之间存在一定的联系,过敏性鼻炎与哮喘属于同一气道,同一疾病,而蛔虫抗体与过敏性鼻炎发病之间关系的研究较少报道。为此,为了解决蛋白纯度和完整抗原表位的问题,以及探讨蛔虫抗体与过敏性鼻炎发病之间的关系,我们进行了本实验,试图得到高纯度和完整抗原表位的蛔虫过敏原融合蛋白,并初步说明蛔虫抗体与过敏性鼻炎之间的关系；同时,我们克隆表达ABA-1蛋白中的主要蛋白ABA-1A1,为融合蛋白和单体蛋白的免疫学及功能研究比较奠定基础。第一章蛔虫过敏原ABA-1融合基因的表达及鉴定一、目的重组并优化蛔虫过敏原ABA-1主要基因,利用大肠杆菌表达系统表达蛔虫主要过敏原ABA-1融合蛋白,纯化并鉴定目的融合蛋白,为免疫治疗、作用机制研究及临床诊断提供物质基础。二、方法从Gene Bank (AF051702)和Protein database (Q06811)中获取蛔虫主要过敏原ABA-1基因和蛋白序列,根据ABA-1B1、ABA-1A4、ABA-1A3、ABA-1A2与ABA-1A1五种蛋白氨基酸序列之间的差异性,选择差异较大的ABA-IB1、ABA-1A2与ABA-1A1基因进行重组,并将新的融合基因命名为BAA,大小为1200 bp；根据大肠杆菌密码子使用的偏爱性和氨基酸密码子的兼并性原则,在不改变氨基酸顺序的基础上,将基因进行优化设计,使优化后的基因更有利于在大肠杆菌中翻译；利用](?)NAStar软件对融合基因的RNA折叠结构进行预测,调整局部氨基酸密码子,使RNA更有利于表达。优化设计后的融合基因BAA送人工合成,将合成的基因BAA构建于表达载体PET-44a上,重组的质粒命名为PET-44a-BAA,然后经KCM法转化入大肠杆菌JM109中进行克隆,经Amp抗性平板筛选后,提取PET-44a-BAA质粒,经NdeⅠ和Pst I双酶切及DNA测序正确后,转化入大肠杆菌RosettaBlueTM中,经Amp抗性平板筛选后,提取PET-44a-BAA质粒,经NdeⅠ和PstⅠ双酶切及DNA测序正确后,37℃空气浴、IPTG诱导表达,新的表达蛋白命名为融合蛋白BAA,取1.5 mL 10000 rpm离心1 min收集菌体,利用12%的SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达情况；融合蛋白BAA菌体经超声破碎后,12%的SDS-PAGE胶判断其主要存在于上清还是包涵体,并利用Ni柱亲和层析纯化；融合蛋白BAA通过Western Blot和氨基酸测序鉴定其过敏原性和是否为目的蛋白。三、结果1、构建了表达质粒PET-44a-BAA大肠杆菌JM109和大肠杆菌RosettaBlueTM中的PET-44a质粒经NdeⅠ和PstⅠ双酶切鉴定,在1200 bp处可见有一特异条带,与目的条带大小相符；经DNA测序,与目的基因进行Blast比对分析,PET-44a上插入的基因序列与目的基因的序列同源性达到100%。这表明,已成功构建PET-44a-BAA质粒。2、表达并纯化出融合蛋白BAA成功在大肠杆菌RosettaBlueTM中诱导表达融合蛋白BAA,其诱导条件为,37℃空气浴200rpm振荡培养100 min,至菌液OD值在0.6-0.7之间,加入IPTG,浓度为0.5 mmol/L,诱导表达3 h,12%的SDS-PAGE鉴定,在45 KD处可见一特异目的条带,其表达量经粗测约占总蛋白的40%左右。经超声裂解12%的SDS-PAGE鉴定后发现,融合蛋白BAA主要存在于上清中；上清蛋白经Ni柱亲和层析,但按照非变性条件(缓冲液中未加入6 mol/L尿素),未能得到纯化结果,在6 mol/L尿素变性条件下,得到了较为理想的纯化结果,纯化后蛋白纯度可达90%左右。3、鉴定了目的蛋白BAA融合蛋白BAA用蛔虫过敏血清经免疫印迹检测后发现,45 KD处可见一特异目的条带,经氨基酸测序,结果显示N端15个氨基酸为T M E H Y L K T Y L S W L T E,经BLAST比对分析,证明该蛋白为目的融合蛋白BAA。4、成功优化了融合基因BAA经对融合基因BAA及融合蛋白BAA的鉴定正确说明,融合基因BAA得到了成功优化。四、结论蛔虫过敏原基因ABA-1可以进行重组优化,重组优化后的基因BAA在大肠杆菌中得到高效的表达,融合蛋白BAA经Ni柱亲和层析可以得到较高的纯度,经鉴定融合蛋白为目的蛋白。第二章蛔虫过敏原ABA-1A1的表达及鉴定一、目的利用PCR技术克隆蛔虫过敏原ABA-1A1基因,构建pET-44a-ABA-1Al表达载体,利用大肠杆菌表达系统表达蛔虫ABA-1A1蛋白,为与融合蛋白BAA的免疫原性及抗原性比较提供物质基础,为蛔虫过敏原的过敏性改造奠定基础。二、方法设计PCR引物A1F:5’CAGCACATACCTCTCGTCGCG3, A1R: 5’AGAGGTATGCACACCATAGATCTTC3’,利用PCR方法从融合基因BAA中转录ABA-1A1基因,利用TA克隆技术将其构建于pEASY2-T3载体上,经蓝白斑筛选、菌落PCR和DNA测序正确后,利用NdeⅠ和PstⅠ将质粒pEASY2-T3-ABA-1A1双酶切后,将ABA-1A1基因构建于表达载体PET-44a上,经KCM法转化入大肠杆菌JM109中进行克隆,PET-44a-ABA-1A1经NdeⅠ和PstⅠ双酶切及DNA测序正确后,转化入大肠杆菌RosettaBlueTM中,经鉴定正确后,用IPTG诱导表达,12% SDS-PAGE检测表达结果,通过Western Blot鉴定目的蛋白；取ABA-1A1菌体,超声破碎后,分别对上清和沉淀进行12%SDS-PAGE检测；ABA-1A1蛋白经Ni柱亲和层析进行纯化。三、结果1、构建了表达质粒PET-44a-ABA-1A1大肠杆菌JM109和大肠杆菌RosettaBlueTM中的PET-44a质粒经NdeⅠ和PstI双酶切鉴定,在400bp处可见有一特异条带,与目的条带大小相符；经DNA测序,与目的基因进行Blast比对分析,PET-44a上插入的基因序列与目的基因的序列同源性达到100%。这表明,已成功构建PET-44a-ABA-1A1质粒。2、表达并纯化出融合蛋白ABA-1A1成功在大肠杆菌RosettaBlueTM中诱导表达蛋白ABA-1A1,其诱导条件为,37℃空气浴200 rpm振荡培养100 min,至菌液OD值在0.6-0.7之间,加入IPTG,浓度为0.5 mmol/L,诱导表达3h,12%SDS-PAGE鉴定,在15 KD处可见一特异目的条带。经超声裂解12%SDS-PAGE鉴定后发现,融合蛋白ABA-1A1主要存在于上清中；上清蛋白经Ni柱亲和层析,得到了较高纯度的ABA-1A1蛋白。3、鉴定了目的蛋白BAA蛋白ABA-1A1用蛔虫过敏血清经免疫印迹检测后发现,15 KD处可见一特异目的条带,证明该蛋白为目的蛋白ABA-1A1。四、结论ABA-1A1在大肠杆菌中得到高效的表达,这为与融合蛋白BAA的免疫学活性研究比较、蛔虫脱敏疫苗研制及过敏原性改造奠定了基础。第三章蛔虫过敏原融合蛋白在过敏性鼻炎发病机制作用中的研究一、目的探讨过敏性鼻炎与蛔虫抗体之间的联系二、方法收集过敏性鼻炎病人及健康人的血清,用融合蛋白BAA做为抗原,利用Wetern Blot方法,检测过敏性鼻炎患者中含有蛔虫过敏原抗体的人数,与健康人蛔虫抗体阳性人数进行比较,探讨蛔虫感染与过敏性鼻炎发病之间的可能联系。三、结果在32个过敏性鼻炎患者中,有10个患者的蛔虫过敏原抗体阳性,抗体阳性率为31.25%,在26个健康对照有2个人蛔虫抗体阳性,蛔虫抗体阳性率为7.69%,对过敏性鼻炎和健康人的蛔虫抗体阳性率进行比较,经X2检验得P<0.05,两者的差异具有显著性。四、结论蛔虫抗体可能与过敏性鼻炎发病有一定的关系,有可能成为一个潜在危险因素。全文结论利用大肠杆菌密码子偏嗜性的特点,对融合基因BAA进行优化设计后,可以在大肠杆菌中得到高效的表达,并得到纯度高抗原表位丰富的融合蛋白BAA；利用PCR方法可以得到蛔虫过敏原ABA-1A1基因,并在顺利表达、纯化并鉴定了A1蛋白,为与融合蛋白BAA的免疫学及功能比较奠定了基础；利用融合蛋白BAA作为抗原经Western Blot调查后发现,蛔虫感染可能与过敏性鼻炎发病有密切关系,可能是过敏性鼻炎发病的一个危险因素。

全文目录


摘要  3-9
ABSTRACT  9-17
前言  17-20
第一章 蛔虫过敏原ABA-1融合基因的表达及鉴定  20-37
  一 材料与方法  20-29
  二 结果  29-33
  三 讨论  33-36
  四 结论  36-37
第二章 蛔虫过敏原ABA-1A1的表达及鉴定  37-47
  一 材料和方法  37-42
  二 结果  42-45
  三、讨论  45-46
  四、结论  46-47
第三章 蛔虫过敏原融合蛋白在过敏性鼻炎发病机制作用中的研究  47-53
  一 材料与方法  47-49
  二 结果  49-51
  三、讨论  51-52
  四、结论  52-53
全文结论  53-54
附图  54-57
参考文献  57-61
中英文缩略词表  61-62
综述  62-68
  参考文献  65-68
攻读学位期间成果  68-69
致谢  69-71
统计学合格证明  71

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