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绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

作　者: 盛鹏程
导　师: 朱瑞良
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: RNA干扰 shRNA 肌肉生长抑制素 慢病毒 qPCR
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 31次
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内容摘要


本研究的目的是构建绵羊myostatin基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并评估其对myostatin基因表达的沉默效果。方法是,在Genebank中检索目的基因的序列,获得sheep的myostatin的序列,根据ambion的shRNA设计系统,设计、合成4对针对myostatin基因shRNA干扰载体。合成全基因序列,将合成好的全基因序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α,测序验证发现有突变点,通过重叠PCR将基因序列中突变点修复,将突变后的全长片段用XhoI和EcoRI酶切后连接至目的载体pCDNA3.1(+),并转化到感受态细胞DH5α中,经测序验证,重组克隆中插入片段序列与目的基因序列完全一致,高效表达载体构建成功。用Lipofeetamine2000将pcDNA3.1-Ovis aries MSTN质粒、shRNA干扰载体共转染至HEK293细胞,48h后取一部分细胞做qPCR,通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量,采用△△C t的方法进行相对定量,使用转染阴性干扰载体的样品作为对照样品,比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达,并计算干扰效果,shRNA-86C的干扰效果最好,基因沉默效率60.13%,对shRNA-86C进行慢病毒包装。将双链的shRNA oligo插入到shRNA表达载体pENTR?/U6 vector中,构建shRNA表达质粒,使用Invitrogen公司的LR重组系统将pENTR/U6-85-C与慢病毒载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行重组。用Lipofeetamine2000将构建的慢病毒表达载体pL-85-C和包装质粒(Packaging Mix)共转染至生长状态良好,处于对数生长期的293T细胞,48h后收集细胞培养上清,3000rpm离心10 min,去除细胞和碎片,并用0.45um的滤器过滤,将病毒原液在50000g下超速离心2小时,去除上清,重悬于500μl DMEM培养液中,病毒感染细胞HEK293细胞,在倒置显微镜下观察各孔中荧光细胞数,病毒滴度为荧光细胞数除以相应的稀释倍数,测定滴度为8.8×10~9TU/ml,说明有大量质粒转入293T细胞,病毒包装成功。为研究基因沉默前后细胞生物学行为的改变和探讨myostatin基因对双肌性状发生发展中的作用提供实验基础。

全文目录


中文摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
引言  9-20
  1 转基因动物研究进展  9-12
    1.1 显微注射法  9-10
    1.2 胚胎干细胞法  10
    1.3 体细胞、胚胎细胞克隆法  10-11
    1.4 精子介导法  11
    1.5 精原干细胞介导法  11
    1.6 逆转录病毒法  11-12
  2 RNA 的技术简史  12-13
  3 RNAi 的分子生物学机制和特性  13-15
    3.1 RNAi 的分子机制  13
    3.2 RNAi 的生物学特点  13-14
    3.3 NA 的获得  14-15
      3.3.1 iRNA  14
      3.3.2 体外转录法合成siRNA  14-15
      3.3.3 siRNA 表达载体  15
      3.3.4 siRNA 表达框架  15
  4 肌肉生长抑制素的研究进展  15-18
    4.1 MSTN 基因的家族成员、功能、结构及作用机制  16-17
    4.2 MSTN 基因的同源性、定位及部分突变位点  17-18
    4.3 MSTN 基因的表达  18
  5 本研究的目的和意义  18-20
绵羊myostatin 基因shRNA 慢病毒载体的构建与鉴定  20-41
  1 材料和方法  20-28
    1.1 材料  20
      1.1.1 菌种、质粒  20
      1.1.2 细胞、培养液  20
      1.1.3 其它试剂  20
    1.2 主要仪器  20-21
    1.3 方法  21-28
      1.3.1 构建shRNA  21-22
      1.3.2 全基因合成及高表达载体构建  22-23
      1.3.3 干扰载体的筛选  23-27
      1.3.4 干扰效果最佳的载体构建为慢病毒干扰载体  27
      1.3.5 慢病毒的包装和病毒滴度的测定  27-28
  2 结果和分析  28-39
    2.1 干扰载体的构建  28-29
    2.2 全基因合成及高表达载体构建  29-33
    2.3 干扰载体在 HEK293 细胞中的干扰评价  33-35
      2.3.1 内参定量结果  33-34
      2.3.2 内参扩增曲线和熔解曲线  34
      2.3.3 目的基因扩增曲线和熔解曲线  34
      2.3.4 目的基因定量结果  34-35
    2.4 干扰效果最佳的质粒载体转为慢病毒载体  35-37
    2.5 慢病毒的包装和滴度的测定  37-39
      2.5.1 慢病毒包装  37
      2.5.2 慢病毒原液滴度测定  37-39
  3 讨论  39-41
结论  41-42
参考文献  42-50
附录  50-51
个人简介  51-52
致谢  52-53
攻读硕士学位期间发表的论文  53-55
硕士学位论文内容简介及自评  55

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 羊
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