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棉纤维起始发育优势基因表达谱和三个新基因的克隆与功能初步分析

作　者: 胡文静
导　师: 郭旺珍
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传学
关键词: 棉花纤维发育 cDNA芯片差异表达基因 qPCR Ghhep GhAOC GhGDSL
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

棉花纤维是纺织工业的重要原料,在国民经济中占有重要地位。纤维的发育从胚珠表皮细胞的分化和突起开始,并决定纤维的最终品质和产量。因此从分子水平阐明棉纤维初始发育的机理以及挖掘影响纤维品质和产量的主要因素,具有重要的理论价值与现实意义。本研究选用近等基因系无绒无絮突变体XinWX、无绒有絮突变体XinFLM的-1DPA、ODPA、+1DPA的胚珠为材料,利用cDNA芯片技术筛选与纤维起始发育相关的基因,通过初步功能分析了解棉花起始发育相关基因的生理生化进程；进一步克隆了三个与纤维发育相关的基因：Ghhep、GhAOC和GhGDSL,通过qPCR初步研究三个基因的功能,研究结果如下：(1)以棉花无绒无絮突变体XinWX、无绒有絮突变体XinFLM早期发育时期(+1DPA、ODPA、-1DPA)的胚珠为实验材料,利用含2.9k棉纤维发育unigenes点的基因芯片进行竞争性芯片杂交分析(杂交芯片以下简称+1DPA, ODPA,-1DPA),通过三次生物学重复,共获得差异表达基因1948个,其中+1DPA、ODPA、-1DPA芯片的差异表达基因数分别为：874个、325个、749个。(2)将cDNA芯片筛选得到的差异表达基因进行BLAST2GO分析,分别从分子功能、生物进程、细胞组分三个方面进行分类。从分子功能上分析将差异基因分为11类：结合类(binding类)391个基因；催化活性类(catalytic activity类)383个基因；运输活性类(transporter activity类)59个基因；转录调控活性类(transcription regulator activity类)38个基因；分子转导活性类(molecular transducer activity类)22个基因；结构分子活性类(structural molecule activity类)13个基因：酶调控活性类(enzyme regulator activity类)9个基因；激活性类(motor activity类)5个基因；抗氧化活性类(antioxidant activity类)3个基因；营养库活性类(nutrient reservoir activity类)2个基因；翻译调控活性类(translation regulator activity类)2个基因；其他功能类(other function类)6个基因。对其中的催化活性类(catalytic activity类)的383个基因进一步分类,得到9个亚类：转移酶活性类(transferase activity类)：131个；水解酶活性类(hydrolase activity类)：107个；氧化反应类(oxidoreductase activity类)：63个；裂解酶类(lyase activity类)：34个；连接酶类(ligase activity类)：11个；异构酶类(isomerase activity类)：7个；脱氨酶类(deaminase activity类)：1个；脱支糖原类(glycogen debranching enzyme activity类)：1个；UDP-L鼠李糖合成酶(UDP-L-rhamnose synthase activity类)：1个；其他功能(other function类)：57个。(3)应用qPCR技术对其中涉及氧化还原酶活性类、水解酶活性类、结合类、运输类等四类分子功能的120个差异表达基因进行验证,其中60个基因获得扩增产物。qPCR分析表明：15个引物在亲本中扩增的产物表达量平均值无显著性差异,45个引物在亲本中扩增的产物表达量平均值有显著性差异,与芯片结果的差异基因符合率是：75%。结果显示,运用基因芯片筛选差异表达基因存在一定的假阳性,但是大部分基因的表达与芯片结果一致。(4)为了进一步了解差异表达基因的组织、器官专化性,以棉花遗传标准系TM-1为研究材料,对芯片验证获得的水解酶活性类(hydrolase activity类)和氧化还原活性类(oxidoreductase activity类)基因进一步进行根、茎、叶和不同纤维发育期表达特征分析。结果表明与纤维伸长发育紧密相关的基因：腺苷5’磷酸硫酸苷还原酶(adenosine 5’phosphosulfate reductase)、GDSL-motif脂肪酶/水解酶蛋白(GDSL-motif lipase/hydrolase protein)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(endo-1,4-beta-glucanase)；与次生壁加厚相关的基因：普鲁兰支链淀粉酶(pullulanase (starch debranching enzyme))、非内键ABC蛋白(non-intrinsic ABC protein);与起始期发育相关的基因：类ABC运输蛋白(ABC-transporter-like protein)、低聚木糖葡聚糖内切糖苷酶(xyloglucan endotransglycosylase)、表达蛋白(expressed protein);在种子中优势表达的基因：低聚木糖葡聚糖内切糖苷酶(xyloglucan endotransglycosylase)、2C型同源蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2C homolog)；在棉花整个发育阶段均有表达的基因：pherophorin-C1的蛋白前体(pherophorin-C1 protein precursor)；在根茎叶中优势表达的基因：未知蛋白(hypothetical protein)、过氧化物酶(peroxidase)、线粒体氧化物2(mitochondrial alternative oxidase 2)、金属鳌合肽酶(metallopeptidase)。对棉花中差异表达基因的不同组织器官qPCR分析为进一步深入研究其功能奠定了基础。(5)运用同源序列比对、网上EST拼接、电子克隆技术对芯片结果中差异表达的三个基因进行全长cDNA克隆,得到与纤维发育相关的三个基因：Ghhep、GhAOC和GhGDSL,通过qPCR初步研究了三个基因的功能,推测Ghhep基因与GhAOC基因的表达与棉纤维次生壁加厚有关,GhGDSL基因的表达与纤维伸长有密切关系。

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中文摘要 6-9ABSTRACT 9-12本文所用主要缩略词 12-14第一部分文献综述 14-36 第一章棉纤维发育相关基因研究进展 14-24 1 棉纤维伸长发育及相关基因研究 14-17 1.1 棉纤维发育分子机制的研究 14-15 1.2 棉纤维的发育过程 15-17 2 植物功能基因组学研究进展 17-19 2.1 基因克隆方法概述 17-18 2.2 生物信息学研究 18 2.3 基因时空表达分析研究 18 2.4 基因功能鉴定与验证 18-19 3 棉花功能基因组学研究进展 19-24 3.1 棉花基因克隆方法进展 19-24 第二章基因芯片技术研究进展 24-34 1 基因芯片技术原理 24 2 基因芯片技术的产生背景与发展近况 24-27 2.1 基因芯片概念的提出与产生背景 24-25 2.2 基因芯片技术的发展近况 25-26 2.3 基因芯片技术在我国的发展 26-27 3 基因芯片的分类 27-29 3.1 光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列 27 3.2 微电子芯片 27-28 3.3 微量点样技术 28-29 3.4 其他技术 29 4 基因芯片技术在作物研究中的应用 29-32 4.1 基因组测序 29 4.2 寻找和鉴定新基因 29-30 4.3 检测基因表达水平 30-31 4.4 后基因组学研究 31-32 4.5 转基因技术的应用 32 5 基因芯片技术在棉花研究中的进展 32-34 本研究目的和意义 34-36第二部分研究报告 36-106 第三章棉纤维启动期差异表达基因分析 36-82 1 材料与方法 38-42 1.1 实验材料 38 1.2 差异表达基因的获得和生物信息学分析 38-40 1.3 RNA的提取与反转录 40-42 1.4 qPCR 42 2 结果分析 42-78 2.1 芯片数据的有效性 42-45 2.2 cDNA芯片竞争杂交获得的差异表达基因 45 2.3 芯片杂交结果的生物信息学分析 45-51 2.4 芯片结果中差异表达基因的符合率验证 51-66 2.5 差异表达基因在TM-1中的表达谱分析 66-78 3 讨论 78-82 3.1 芯片结果的数据分析 78-80 3.2 芯片结果中差异表达基因在亲本中验证 80 3.3 与纤维极性伸长和次生壁加厚相关基因的研究 80-82 第四章三个棉花新基因的克隆 82-106 1 材料和方法 82-84 1.1 材料 82-83 1.2 方法 83-84 2 结果和分析 84-103 2.1 Ghhep基因克隆与表达分析 84-92 2.2 GhAOC的克隆和表达分析 92-97 2.3 GhGDSL基因的克隆和表达分析 97-103 3 讨论 103-106全文结论 106-108参考文献 108-114附录 114-120致谢 120

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