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MicroRNA-148a/b在胃癌中的表达及其功能与机制研究

作　者: 石晓磊
导　师: 王为忠；聂勇战
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: 胃癌转移 microRNA miR-148a miR-148b PrPc
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【背景】MicroRNA是近年发现的一类长约21-25个核苷酸片段的非编码的小分子RNA,其通过与靶mRNA3‘非翻译区结合,在转录后水平形成RNA诱导的基因沉默复合体影响mRNA的翻译,从而发挥其生物学功能,影响生物体发育,细胞增殖、凋亡、分化等。其在肿瘤的发生、发展方面也有着重要的作用。胃癌作为世界上发病率第四、肿瘤相关性死亡率第二的疾病,像其它恶性肿瘤一样,其发生、发展也受遗传学和表观遗传学多级联的复杂调控。虽然很多研究证明microRNA与胃癌存在密切的相关性,但其在胃癌的功能及潜在的机制仍然不明。一些研究已经证实胃癌组织中存在很多microRNA分子的差异表达,并且发挥着促癌基因或抑癌基因的作用。我们参考国内外相关文献关于胃癌microRNA表达谱的研究,初步预测microRNA-148a/b在胃癌中存在着差异表达,并发挥着特殊的生物学功能。本课题将对microRNA-148a/b在胃癌的表达水平及功能与作用机制进行初步的探讨。【目的】1、检测microRNA-148a/b在胃癌组织中的表达水平。2、研究microRNA-148a/b在胃癌中的功能。3、构建microRNA-148a/b慢病毒表达载体。4、探讨microRNA-148a/b在胃癌发挥功能的可能机制。【方法】1、收集23例胃癌患者手术切除后的肿瘤组织及癌旁组织标本,提取组织中的总RNA,qPCR检测microRNA-148a/b在癌组织和癌旁组织中的相对表达量,使用相对定量法分析其表达差异。2、运用microRNA-148a/b-mimics化学合成物,通过脂质体瞬时转染的方法,转染人胃癌MKN28 , SGC7901细胞,使胃癌细胞内microRNA-148a/b水平升高,进行划痕和transwell迁移实验,测定其对胃癌细胞迁移能力的影响。3、构建microRNA-148a/b慢病毒过表达载体,经测序鉴定正确后,进行病毒的包装与滴度检测。并用构建好的microRNA-148a/b慢病毒表达载体感染人胃癌SGC7901细胞,qPCR鉴定microRNA-148a/b在感染细胞中的表达效果。4、运用生物信息学分析软件TargetScan、MiRanda预测microRNA-148a/b可能的靶基因,并对预测结果应用DAVID数据库进行功能聚类分析,选择与抑制细胞侵袭、迁移能力相关的抑癌相关基因。对其预测的靶基因编码蛋白用Western-blot方法进行检测其在microRNA-148a/b上调胃癌细胞MKN28内的表达变化。【结果】1、MicroRNA-148a/b在胃癌组织中表达显著低于相对应的癌旁组织。2、划痕实验和transwell实验提示,运用miR-148a/b-mimics通过脂质体瞬时转染使胃癌细胞MKN28和SGC7901内miR-148a/b升高,肿瘤细胞迁移能力显著减弱。3、成功构建了microRNA-148a和microRNA-148b的两个慢病毒表达载体,经双酶切电泳及测序鉴定正确。用构建好的慢病毒载体感染人胃癌SGC7901细胞, qPCR鉴定其表达效果,结果显示能显著上调microRNA-148a/b在细胞内的表达水平。4、生物信息学预测显示PrPc为microRNA-148a/b的可能靶基因之一,Western-bolt结果显示,在microRNA-148a/b上调的胃癌细胞MKN28内, PrPc表达显著降低。【结论】1、MicroRNA-148a/b在胃癌组织中低表达。在体外,上调microRNA-148a/b后能显著抑制胃癌细胞的迁移能力。提示其可能为一个抑癌基因,起到抑制胃癌侵袭、转移的作用。2、PrPc为micriRNA-148a/b可能的靶基因之一,提示其可能通过抑制PrPc的表达而发挥抑制胃癌侵袭和转移。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-17
文献回顾  17-36
第一部分 MiR-148a/b 在胃癌中的表达水平检测  36-46
  1 材料  36-37
  2 方法  37-40
  3 结果  40-43
  4 讨论  43-46
第二部分 MiR-148a/b 抑制胃癌的侵袭和迁移  46-58
  1 材料  46-47
  2 方法  47-51
  3 结果  51-56
  4 讨论  56-58
第三部分 MiR-148a/b 慢病毒表达载体的构建与鉴定  58-84
  实验一 MicroRNA-148a/b 过表达慢病毒载体构建  58-73
    1 材料  58-60
    2 方法  60-72
    3 结果  72-73
  实验二 microRNA 过表达慢病毒载体的包装与滴度检测  73-79
    1 材料  74
    2 方法  74-76
    3 结果  76-79
  实验三 microRNA-148a/b 过表达慢病毒载体效果鉴定  79-84
    1 材料  79
    2 方法  79-80
    3 结果  80-82
    4 讨论  82-84
第四部分 MiR-148a/b 靶基因的生物信息学分析及验证  84-91
  1 材料  84-86
  2 方法  86-87
  3 结果  87-89
  4 讨论  89-91
小结  91-92
参考文献  92-105
个人简历和研究成果  105-106
致谢  106-107

MicroRNA-148a/b在胃癌中的表达及其功能与机制研究

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