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EMT相关蛋白在肝细胞肝癌组织中的表达鉴定及相关microRNA表达谱的研究

作　者: 周顺
导　师: 张建平
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 肝细胞肝癌转移 EMT microRNA 免疫组化实时定量PCR
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肝细胞肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率仅次于胃癌居于恶性肿瘤病死率的第二位,我国每年肝癌死亡人数占全球死亡人数的53%。肝癌易于转移扩散是肝癌患者失去最佳治疗时机和预后不良的主要原因。因此,探索肝癌发生、发展和侵袭转移的分子机制,寻找新防治靶点,对提高肝癌的疗效具有重要的意义。肿瘤的转移是一个复杂、多因素参与的过程,具体机制尚不清楚,其中上皮间质转化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)在肿瘤的侵袭转移中具有重要的作用。EMT是指上皮细胞在特定的情况下向间质细胞转分化的现象,其主要的特征为上皮细胞粘附分子(如E-cadherin)表达的丧失,并获得间质细胞的特性(成纤维细胞样的外形,波形蛋白Vimentin的重新表达)。在肿瘤转移过程中,这种表型的转换允许肿瘤细胞摆脱细胞-细胞间连接,使肿瘤细胞更易于侵袭和转移。MicroRNA(miRNA)是一类长约17-25nt的单链内源性非编码RNA,其在体内的主要功能是采用降解靶mRNA和结合于靶mRNA的3’UTR端抑制其翻译两种作用方式调控基因的表达。有研究显示,miRNA作为体内调控基因表达的重要分子,参与了EMT相关分子的表达调控,从而在肿瘤转移的过程中发挥重要作用。因此,探索EMT与肝癌转移的关系,寻找参与调控肝癌EMT与转移的miRNAs对防治肝癌转移、改善肝癌患者预后显得尤为重要。本课题组利用免疫组化检测了EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin在前期收集32例肝癌组织中的表达情况。结果显示在肝癌组织中E-cadherin表达降低、vimentin表达增高与肝癌的分化程度(低分化/未分化)和转移具有明显的相关性(P﹤0.05)。进一步利用miRNA芯片技术对其中转移肝癌组织和无转移肝癌组织中差异表达的miRNAs进行初步筛选,共获得差异表达miRNAs 36个。其中,在转移肝癌组织中8个miRNAs表达上调,28个miRNAs表达下调。选取其中四个差异表达miRNAs在肝癌组织中进行实时定量RT-PCR的验证,结果显示在E-cadherin(-)/vimentin(+)转移肝癌组织中,miR-21、miR-221的表达明显高于E-cadherin(+)/vimentin(-)无转移的肝癌组织(p<0.05);miR-199a、miR-126的表达明显低于E-cadherin(+)/vimentin(-)无转移的肝癌组织(p<0.05),提示这些miRNAs可能通过调控肝癌EMT进而调控肝癌的转移。联合多种miRNA靶基因预测软件对miR-21、miR-199a、miR-126、miR-221的靶基因进行预测,发现该四种miRNAs的靶基因涉及到细胞分化、原癌基因激活、转录调控、细胞信号传导通路等诸多与肿瘤发生和转移相关的病理生理过程,为进一步研究其在肝癌发生发展和转移过程中的作用提供新的线索。1.利用免疫组化检测前期收集的肝癌组织中EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达情况,并分析其与临床病理资料的关系。2.提取肝癌组织中总RNA,分离miRNA,与miRNA V4.0芯片杂交,扫描芯片,筛选差异表达miRNAs,并行数据归一化处理。3.应用实时定量PCR对部分差异表达miRNAs在肝癌组织中进行验证。4.利用生物信息学方法对部分差异表达miRNAs的靶基因进行预测。1.免疫组化检测前期收集32例肝癌组织中EMT相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达情况。结果显示在肝癌组织中E-cadherin表达降低、vimentin表达增高与肝癌的分化程度(低分化/未分化)和转移具有明显的相关性(P﹤0.05)。2. miRNA V4.0芯片杂交后,对数据进行归一化处理,筛选出差异表达miRNAs 36个,其中上调表达miRNAs 8个,下调表达miRNAs 28个。3.实时定量PCR结果显示:在E-cadherin(-)/vimentin(+)转移肝癌组织中,miR-21、miR-221的表达明显高于E-cadherin(+)/vimentin(-)无转移的肝癌组织(p<0.05);miR-199a、miR-126的表达明显低于E-cadherin(+)/vimentin(-)无转移的肝癌组织(p<0.05)。4.联合多种miRNA靶基因预测软件对miR-21、miR-199a、miR-126、miR-221的靶基因进行预测,发现该四种miRNAs的靶基因涉及到细胞分化、原癌基因激活、转录调控、细胞信号传导通路等诸多与肿瘤发生和转移相关的病理生理过程。1. EMT在HCC中客观存在,并且与HCC的转移密切相关。2.商业化的miRNA芯片是高通量筛选肿瘤相关miRNAs差异表达的有效方法。初步构建了肝细胞肝癌EMT及转移相关miRNA差异表达谱。3. miR-21、miR-221、miR-199a、miR-126在肝癌EMT及转移过程中具有潜在的调控机制。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-10
前言  10-11
第一部分肝细胞肝癌组织中 EMT 相关蛋白的检测  11-19
  1.1 材料与方法  11-14
  1.2 结果  14-17
  1.3 讨论  17-19
第二部分肝细胞肝癌 EMT 相关 microRNAs 差异表达谱的筛选  19-27
  2.1 材料和方法  19-23
  2.2 结果  23-25
  2.3 讨论  25-27
第三部分部分差异表达 miRNA 实时定量 RT-PCR 验证及靶基因预测  27-43
  3.1 材料和方法  27-31
  3.2 结果  31-38
  3.3 讨论  38-43
小结  43-44
综述  44-49
参考文献  49-52
致谢  52-53

EMT相关蛋白在肝细胞肝癌组织中的表达鉴定及相关microRNA表达谱的研究

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