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Let-7a内源性小分子RNA对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用

作　者: 吴凯
导　师: 吴爱国
学　校: 南方医科大学
专　业: 普通外科学
关键词: let-7a microRNA 乳腺癌 c-myc基因
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

据资料统计,我国乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%,随着人口城市化的加速,乳腺癌发生率及病死率有逐年上升的趋势,特别在沿海城市,发病率较以前有明显的增长。乳腺癌的发病多与遗传有关,发病年龄通常在40—60岁之间,绝经期前后的妇女发病率较高,是严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。目前手术治疗仍然是乳腺癌治疗的主要手段,手术治疗经历了由不做手术、扩大范围的根治术、改良根治术,以及目前主张的保乳手术的演变过程,随着化疗、放疗及内分泌等综合治疗的应用,乳腺癌患者的生存率已经有了明显的提高,但仍有相当一部分患者存在复发或对常规治疗耐药问题。因此,找到一种新型的抗癌药物与治疗手段显得尤为必要。随着对恶性肿瘤发病的基因和分子机制研究的不断深入,人们发现恶性肿瘤从遗传学和分子生物学角度来看,是一种基因病,即癌基因的激活和抑癌基因的失活以及基因表达调控失常所致。肿瘤的发生分子基础是多种基因突变长期、多阶段、多步骤的积累过程。以肿瘤细胞中特有的结构、功能区域、分子基团、生物酶以及信号转导通路为治疗位点,通过调节或阻断这些分子功能达到治疗疾病目的的靶向治疗药物已经问世,并在临床得到应用。由于这类药物对肿瘤细胞起调节作用和稳定性作用,且具有非细胞毒性和靶向性的特点,必将成为一种新的肿瘤治疗手段。RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-strand RNA, dsRNA)引发的广泛存在于生物体中的序列特异性基因转录后的沉默过程。利用RNAi技术可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默,这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene Silencing, PTGS)最终抑制蛋白表达。dsRNA在细胞内发挥作用的是21-23核昔酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, SiRNAs)。由于RNAi对染色体DNA序列的复制和转录过程不产生任何影响,具有高度的序列特异性和抑制基因表达的高效性,而且RNAi的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持,或在某些生物中具有遗传性,所以迅速成为一种功能强大的研究哺乳动物中选择性抑制特异性基因表达和研究基因功能的工具。微小RNA(micro-RNA, miRNA)是真核生物中一类长度在18-25个核苷酸的内源性非编码单链RNA,也是dsRNA的一种。mi RNA通过识别其相应的靶mRNA,可以降解mRNA或抑制mRNA转录后的翻译,从而抑制蛋白的合成。mi RNA基因表达在多种恶性肿瘤中均有明显的改变,包括慢性淋巴细胞白血病,小儿伯基特淋巴瘤,胃癌,肺癌,大细胞淋巴瘤等。在肿瘤的形成过程中,mi RNA的生物合成的异常使得肿瘤细胞基因表达发生异常,发挥着类似癌基因和抑癌基因作用,最终导致发育缺陷和癌症形成。Let-7是目前研究较多的一种miRNA,在研究线虫过程中首次发现,其在细胞生长分化、细胞凋亡、组织发育、脂肪代谢及胚胎干细胞的形成过程中发挥着重要作用。肿瘤细胞中let-7家族通常是下调的,过去的大量研究表明,let-7被认为是肿瘤的抑制者及细胞终分化和增殖的调控器,其在肿瘤细胞形成、增殖及凋亡中均发挥着重要作用。利用let-7干扰肿瘤细胞的生长可能成为一种新的肿瘤治疗手段。Let-7通过调节转录因子在细胞生长、细胞分化调控、与细胞凋亡中发挥着重要作用。c-myc基因属于myc原癌基因家族,定位于染色体8q24, c-myc基因主要通过扩增和染色体易位重排的方式激活,在某些组织肿瘤的发生、发展和演变转归过程中发挥重要关系。c-myc癌基因属核蛋白基因,具有转化细胞的能力,并具有与染色体DNA结合的特性,在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用。c-myc的表达活性与细胞生长、分裂速度密切相关,而且也是细胞凋亡的潜在诱导因子。在不同的人体肿瘤细胞系中,包括粒细胞性白血病细胞系,视网膜母细胞瘤细胞系,某些神经母细胞病细胞系,乳腺癌细胞系及某些肺癌细胞系,已发现c-myc过度表达。c-myc基因还参与了肿瘤的血管新生,在肿瘤的生成过程中,c-myc基因扮演着控制血管生长作用,其在肿瘤生长增殖及转移中发挥的重要作用。IMPI基因是一种与let-7高度互补的癌胚基因,一般只在早期胚胎干细胞和一些癌细胞中表达。Let-7能够靶向干扰IMP1,使IGF-IR磷酸化,进而激活Ras-MAPK途径和PI3K-Akt／PKB途径信号传导通路,控制相应信号传导通路中关键基因的表达,调节肿瘤细胞的生长、分化、增殖、凋亡。C-myc基因是PI3K-Akt／PKB信号传导通路的关键基因之一,其在乳腺癌细胞增殖、凋亡、分化、转移中发挥着重要的作用。以往进行的实验表明,myc基因可以与let-7的启动子结合,间接下调let-7的转录。采用计算机进行序列分析发现let-7与myc存在高度互补,这为探索let-7干扰乳腺癌细胞机制提供了理论依据。基于前述国内外研究现状,在小分子RNA干扰技术日渐成熟的基础上,本研究拟合成let-7a,利用脂质体将其导入乳腺癌MCF-7细胞中,运用CCK-8及流式细胞术检测乳腺癌细胞的增殖及凋亡情况,运用反转录PCR和免疫印迹的方法检测c-myc基因及蛋白表达情况,探索let-7a对乳腺癌细胞的作用机制。目的人工设计合成经HPLC纯化let-7a,利用脂质体转染体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞,观察其对的细胞增殖、凋亡的影响,并利用分子生物学实验检测乳腺癌细胞中c-myc的基因及蛋白表达情况,探索其可能的作用机制。为miRNA应用于乳腺癌的基因治疗提供理论及实验依据。方法1.根据GenBank中报道的let-7a基因核苷酸序列,使用BLAST排除和其他编码序列／EST同源的序列,人工设计合成Let-7a及阴性对照siRNA,合成以双链形式保存,末端以绿色荧光蛋白标记,利用脂质体LipofectamineTM2000,将let-7a转染至乳腺癌MCF-7细胞中,分别转染6h、12h、24h后,利用光学显微镜观察细胞膜及细胞核的变化,利用荧光显微镜观察细胞转染情况；2. Let-7a组设200nmol/L、100 nmol/L、50 nmol/L、20 nmol/L四个组,阴性对照siRNA浓度为100 nmol/L,另设空白对照组,共六个组。使用脂质体转染MCF-7细胞,分别设24h、48h、72h三个时间点,加入CCK-8 lh后分光光度计检测OD值,计算细胞生长抑制率,检测人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡情况。3.设let-7a组(浓度为100nmol/L)及脂质体转染组,转染72h后加入AnnexinV-FITC及PI试剂,流式细胞仪(FCM)检测let-7a对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响；4.分为let-7a组、阴性对照siRNA组(浓度为100nmol/L)及脂质体对照组,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测脂质体转染48h后MCF-7细胞中c-myc基因mRNA的表达,以内参校正灰度值,经统计学分析后比较各处理组的差别；5.实验分let-7a组、阴性对照siRNA组(浓度为100nmol/L)及脂质体对照组三个组,Western blot方法检测转染48h后MCF-7细胞中c-myc蛋白的表达,比较各处理组校正灰度值的差异；结果1.光学显微镜管观察转染24h后let-7a组细胞出现胞膜中断,细胞核改变,而阴性对照siRNA组细胞生长良好；荧光显微镜证实let-7a及阴性对照组siRNA均可以成功转染至乳腺癌细胞,转染各个时间点,两组之间的转染效率无显著性差异,且细胞对let-7a及阴性对照siRNA组的摄取随着时间的推移而增加；2.应用let-7a转染人乳腺癌MCF-7细胞,CCK-8检测显示let-7a对乳腺癌细胞生长具有明显抑制作用,在浓度200nmol/mL至20nmol之间,抑制率呈剂量相关性,即浓度越低抑制作用越弱,经两两比较,各浓度组之间的抑制率均有显著差异(P均<0.05)。阴性对照siRNA组对乳腺癌MCF-7也有一定的抑制作用,与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05),但let-7a对MCF-7细胞的抑制作用明显高于阴性对照及空白对照组,经统计学分析,具有显著差异性(P=0.000)。分别观察24h、48h、72h浓度为200 nmol/ml、100nmol/ml、50 nmol/ml、20nmol/L let-7a、100 nmol/ml阴性对照siRNA组及脂质体转染组对MCF-7的抑制作用,可明显看出let-7a转染组随着时间延长,对细胞杀伤作用越明显,而脂质体转染组变化不明显；3.流式细胞仪检测显示MCF-7细胞经let-7a组及脂质体组处理72h后,let-7a转染组细胞凋亡率为(25.40±1.78)%,脂质体转染组细胞凋亡率为(4.89±0.68)%, let-7a转染细胞凋亡比例显著增加,两者比较有显著性差异(t=34.071,P=0.000)：4.MCF-7细胞内存在c-myc mRNA,转染let-7a 48h后mRNA含量(0.510±0.024)明显低于脂质体对照组(0.634±0.008)和阴性siRNA转染组(0.631±0.007),比较有统计学差异(F=220.384,P=0.000)；5.Western blot检测表明在MCF-7细胞中存在分子量62kD的特异性条带,与c-myc分子量相符,let-7a组在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组,各组校正灰度平均值为：let-7a组(0.663±0.007)、阴性对照siRNA组(0.697±0.007)、脂质体对照组为(0.706±0.005),let-7a对c-myc蛋白的影响明显强于脂质体对照组及阴性对照siRNA组,差异具有统计学意义(F=102.450,P=0.000)。结论1.let-7a可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,并促进MCF-7细胞凋亡；2.let-7a可以干扰乳腺癌MCF-7细胞中的c-myc基因及蛋白的表达,这可能是let-7a干扰乳腺癌细胞生长及促进细胞凋亡的机制；3.小分子RNA干扰技术具有极大的试验研究和临床研究价值,microRNA干扰肿瘤细胞将成为乳腺癌的基因治疗的一个新的研究方向。

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摘要  3-9
ABSTRACT  9-16
绪论  16-21
技术路线  21-22
材料与试剂  22-28
实验方法  28-36
结果  36-42
讨论  42-47
结论  47-48
参考文献  48-52
综述  52-60
中英文对照缩略词表  60-62
攻读学位期间成果  62-63
致谢  63-65
研究生毕业论文统计学审稿证明  65

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