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基于microRNA调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺病毒的研究

作　者: 吕赛群
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: microRNA let-7 溶瘤腺病毒 肝癌 病毒治疗 基因治疗
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本论文将肿瘤特异性表达缺失或下调的microRNA引入作为溶瘤腺病毒新的调控靶点,对该溶瘤腺病毒治疗系统的靶向性和安全性进行了探索性的研究。背景:microRNA是近年来的一个研究热点,可与其靶基因3’UTR中的靶序列互补配对结合,负向调控靶基因的翻译水平。研究表明,一些microRNA的表达量常在肿瘤细胞中异常下调,而这种异常下调往往与肿瘤发生发展过程关系密切。let-7是较早发现的微小RNA之一,表达于多数正常组织细胞,然而在肺癌的研究中发现,肺癌病人的let-7表达显著降低,且let-7表达水平越低,其预后越差,术后生存期越短[1]。Yong Sun Lee和Anindya Dutta[50]发现let-7会结合HMGA2 mRNA转录产物的3’端,并抑制该基因在肿瘤细胞中的过量表达。Johnson, SM[51]和Christensen B. C.[52]等还发现let-7负调控RAS蛋白的表达。2007年我国科学家宋尔卫教授[53]发现let-7通过对多个靶标的调控,实现对自我更新的乳腺癌细胞BT-IC(乳腺肿瘤起始细胞)的调节。在前期研究中,我们发现let-7在肝癌细胞中也异常下调,于是我们将携带有let-7a靶位点的溶瘤腺病毒分别感染microRNA hsa-let-7a常量表达的正常细胞株L02、WRL-68以及hsa-let-7a低表达的肝癌细胞株Hep3B、PLC,探索该溶瘤腺病毒是否能在正常细胞中基本不复制增殖,而在肿瘤细胞中特异性复制增殖,从而达到溶瘤腺病毒特异性靶向肿瘤细胞而减少对正常细胞的毒害作用的效果。方法与结果:首先运用qRT-PCR的方法筛选let-7a常量表达的正常细胞株L02、WRL-68以及let-7a低表达的肝癌细胞株Hep3B、PLC。构建携带有let-7a靶位点核苷酸序列的克隆载体pXC1-let-7T,将pXC1-let-7T与腺病毒骨架质粒pPE3-F11B在HEK293细胞内重组,获得基于let-7调控的溶瘤腺病毒,PCR鉴定正确后命名为Ad5/11-Let-7T。将此病毒在293细胞中大量繁殖,应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒。以同样的方法获得获得基于一段let-7随机突变靶序列调控的溶瘤腺病毒Ad5/11-Let-7MT。将本实验室生产的对照病毒WAd5和Ad5/11-Let-7T、Ad5/11-Let-7MT分别感染上述筛选出的4个细胞株,用qRT-PCR方法检测RNA水平E1A蛋白表达量,用Western blotting方法检测蛋白水平E1A蛋白表达量,结果均显示Ad5/11-Let-7T在正常细胞中的E1A蛋白只有少量表达或不表达,而在肿瘤细胞中则高效表达;用增殖实验表明Ad5/11-Let-7T能在肝癌细胞Hep3B和PLC中大量复制,而在正常细胞L02和WRL-68中复制能力却很弱;同样MTT实验表明Ad5/11-Let-7T对正常细胞杀伤能力较弱,而对肿瘤细胞的杀伤能力则和对照病毒WAd5、Ad5/11-Let-7MT相当;分别将携带有绿色荧光报告基因的溶瘤腺病毒Ad5/11-EGFP、Ad5/11-Let-7T-EGFP和Ad5/11-Let-7MT-EGFP感染正常细胞L02、WRL-68及肝癌细胞Hep3B、PLC,观察荧光显示感染了Ad5/11-Let-7T-EGFP的正常细胞中绿色荧光持续单簇、分散存在,而在肿瘤细胞中随时间的延长,绿色荧光的表达逐渐由单个变为集中直至渐渐消散,说明Ad5/11-Let-7T-EGFP在肿瘤细胞中快速复制增殖的过程。BALB/c裸鼠皮下建立Hep3B移植瘤模型,随机将成瘤的裸鼠分为3组,分别进行瘤体内注射PBS、WAd5、Ad5/11-Let-7T治疗。自接种之日起,定期测量肿瘤体积;28d后取出肿瘤组织制作成石蜡病理切片,将切片进行HE染色,观察组织病变情况,以及免疫组化检测Hexon抗原。体内实验结果显示,溶瘤腺病毒Ad5/11-Let-7T的体内抑瘤作用良好,疗效明显优于PBS对照组;并能达到和WAd5对照组相似的治疗效果,说明let-7a靶序列的插入并没有影响溶瘤腺病毒对肿瘤的杀伤作用。综上所述,我们构建的携带有let-7a靶位点的溶瘤腺病毒在特异性杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞的杀伤作用大大减少,充分说明Ad5/11-Let-7T是一种安全并且有效的溶瘤腺病毒。通过本课题的研究,可首次将肿瘤特异性表达缺失或下调的microRNA引入作为溶瘤腺病毒新的调控靶点,为溶瘤腺病毒靶向性的调控策略提供新的思路与方案;同时这种基于microRNA的调控方式可与其它靶向调控方式相结合,为建立靶向性更高的溶瘤腺病毒载体系统作好铺垫。

全文目录


摘要  8-10
英文摘要  10-16
缩略词表  16-18
第一章 前言  18-23
  1. 肿瘤的靶向基因-病毒治疗发展概况  18
  2. 溶瘤腺病毒的发展概况及改造策略  18-20
  3. microRNA 简介  20-21
  4. Let-7 在肿瘤方面的研究进展  21
  5. 基于microRNA 调控的溶瘤病毒研究进展  21-23
第二章 基于microRNA 调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺病毒的构建与制备  23-43
  1. 材料方法  23-26
    1.1 实验载体及试剂  23-24
    1.2 主要仪器  24
    1.3 主要试剂的配制  24-25
    1.4 所需引物  25-26
  2 载体构建步骤及方法  26-36
    2.1 载体构建步骤（流程示意图见附录一）  26
    2.2 腺病毒穿梭载体pXC1-MIRT 的构建及鉴定  26-28
    2.3 携带let-7 靶位点核苷酸序列的克隆载体pXC-let-7T 的构建及鉴定  28-30
    2.4 携带let-7 靶位点突变核苷酸序列的克隆载体pXC-let-7MT 的构建及鉴定..  30-32
    2.5 293 细胞培养  32
    2.6 溶瘤腺病毒Ad5/11-Let-7T、Ad5/11-Let-7MT 的重组及鉴定  32-34
    2.7 病毒扩增  34
    2.8 氯化铯密度梯度离心法纯化病毒  34-35
    2.9 5096组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度  35-36
  3 实验结果  36-41
    3.1 腺病毒穿梭载体pXC1-MIRT 的构建  36-37
    3.2 携带let-7 靶位点核苷酸序列的克隆载体pXC1-let-7T 的构建  37-38
    3.3 携带let-7 靶位点突变核苷酸序列的克隆载体pXC1-let-7MT 的构建  38-39
    3.4 溶瘤腺病毒Ad5/11-Let-7T、Ad5/11-Let-7MT 的重组及鉴定  39-41
    3.5 大量扩增后测定病毒滴度  41
  4 讨论  41-43
第三章 基于microRNA 调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺病毒治疗肝癌的体外实验  43-67
  1 实验材料  43-49
    1.1 实验质粒  43
    1.2 实验引物  43-44
    1.3 实验细胞株  44
    1.4 实验腺病毒  44
    1.5 实验试剂  44-45
    1.6 实验仪器设备  45-46
    1.7 实验溶液的配制  46-49
  2 实验方法及步骤  49-54
    2.1 细胞培养  49
    2.2 qRT-PCR 检测细胞中hsa-let-7a 表达量  49-50
    2.3 双荧光素酶报告基因检测let-7 靶序列抑制报告基因的表达情况  50-51
    2.4 蛋白免疫印迹分析  51-52
    2.5 qRT-PCR 检测感染病毒后的细胞E1A 基因表达量  52-53
    2.6 病毒增殖实验  53
    2.7 荧光显微镜下观察溶瘤腺病毒的增殖情况  53-54
    2.8 细胞活力检测  54
  3 实验结果  54-64
    3.1 qRT-PCR 检测细胞中hsa-let-7a 表达量  54-55
    3.2 双荧光素酶报告基因检测let-7 靶序列抑制报告基因的表达情况  55-56
    3.3 蛋白免疫印迹分析  56-57
    3.4 qRT-PCR 检测感染病毒后的细胞E1A 基因表达量  57-58
    3.5 病毒增殖实验  58-59
    3.6 荧光显微镜下观察溶瘤腺病毒的增殖情况  59-61
    3.7 细胞活力检测（MTT 法）  61-64
  4 讨论  64-67
第四章 基于microRNA 调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺病毒治疗肝癌的体内实验  67-74
  1 实验材料  67-68
    1.1 实验试剂及腺病毒  67
    1.2 实验仪器设备  67-68
    1.3 实验动物  68
  2 实验方法及步骤  68-70
    2.1 BALB/c 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立  68
    2.2 体内实验  68-69
    2.3 组织标本取材  69
    2.4 常规病理检查  69
    2.5 免疫组化染色检测Hexon 抗原  69-70
    2.6 统计处理  70
  3. 实验结果  70-72
    3.1 裸鼠肝癌Hep38 移植瘤模型的建立  70
    3.2 瘤内注射PBS、WAd5/11-Let-7T 治疗Hep38 移植瘤疗效观察  70-72
  4 讨论  72-74
全文小结  74-77
  1. 基于microRNA 调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺Ad5/11-Let-7T 的构建  74
  2. 基于microRNA 调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺Ad5/11-Let-7T 治疗肝癌的体外实验  74-75
  3. 基于microRNA 调控靶向肿瘤细胞的溶瘤腺Ad5/11-Let-7T 治疗肝癌的体内实验  75-77
参考文献  77-82
致谢  82-83
附录一  83-87

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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