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microRNA在乳腺肿瘤患者组织和血清中表达的变化和相关性

作　者: 王凤军
导　师: 郭江峰
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: MicroRNA 乳腺肿瘤血清分子标记物诊断治疗
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,其组织学形态多种多样,是一类高度异质性的肿瘤,因此正确评估其临床病理特征对正确诊断,积极采取有效的治疗模式和预后分析具有重要意义。虽然目前对肿瘤分子机制研究的不断深入和乳腺肿瘤诊断和治疗的不断进展,但乳腺癌仍属于死亡率最高的女性恶性肿瘤。MicroRNA(miRNA)在乳腺肿瘤发生与发展过程中呈现出不同的表达水平,具有筛查和诊断乳腺肿瘤并对治疗方案的选择和预后分析具有潜在的指示作用。然而普遍共识的癌症特异性的miRNA表达谱的研究仍只局限于肿瘤组织样本的检测中,而血清作为生物检测样本,具有取材方便,无创伤性,可连续体外检测的优点,且血清miRNA的高度稳定性也使得病人的实际值与实验的测试值相当吻合。因此,系统分析乳腺肿瘤患者组织与血清中miRNA表达的相关性,以及基于荧光定量PCR技术在血清水平上检测乳腺肿瘤相关miRNA的差异性表达情况并挖掘其作为潜在的血清学肿瘤标记物的角色,对乳腺肿瘤进行筛查,病理分析及无创性诊断具有重要意义。本文首先提取48例有明确的细胞学诊断,手术前未经任何放疗、化疗及内分泌治疗,手术后有完整的临床及病理资料的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清样本及20例健康志愿者的血清样本中的总RNA,然后通过设计特异性的茎环引物和PCR引物,利用荧光定量技术分析由大量文献数据筛选出的与乳腺肿瘤极其相关的目标miRNA(miRNA-21, 106a, 126, 155, 199a和335)在乳腺组织和血清中的差异性表达情况。通过研究发现,目标miRNA在血清中稳定存在并表达,且其在血清中的表达变化与性别无相关性。6个目标miRNA在乳腺肿瘤组织和血清中均呈现出显著的差异性表达,并在乳腺肿瘤组织和血清中的表达水平具有显著的相关性(R2=0.853)。其中,在乳腺肿瘤组织相对于其癌旁正常组织以及乳腺肿瘤患者的血清相对于健康志愿者的血清中,miR-21,miR-106a和miR-155呈现出显著的高表达,而miR-126,miR-199a和miR-335则显著低表达(P<0.05)。此外,6个目标miRNA还分别与不同的乳腺肿瘤的临床病理特征(如肿瘤组织学病理分级和雌、孕激素受体的蛋白表达水平)密切相关,在组织学和血清学水平上均具有一定的指示作用。以上结果为疾病特异性miRNA表达谱可作为一类新的肿瘤检测,诊断和治疗的血清生物标志物提供一种新的理论和实验基础。检测血清miRNA的差异性表达水平作为一种敏感、特异、简单的临床诊断技术,可用于肿瘤等疾病的早期诊断中。该技术必将推动以血清等生物体液样本的相关研究领域的探索和发现。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-14
插图目录  14-15
表格目录  15-16
略语表  16-17
第一章文献综述  17-37
  1 microRNA (miRNA)与肿瘤  17-22
    1.1 miRNA 概述  17-19
      1.1.1 miRNA 的生物学特征  17
      1.1.2 miRNA 的加工和作用机制  17-19
      1.1.3 miRNA 的生物学功能  19
    1.2 miRNA 与肿瘤相关性研究进展  19-22
      1.2.1 miRNA 与肿瘤发生  19-21
      1.2.2 miRNA 与肿瘤诊断  21-22
      1.2.3 miRNA 与肿瘤的基因治疗  22
  2 乳腺癌及其相关miRNA 的研究进展  22-28
    2.1 乳腺癌研究进展  22-23
    2.2 乳腺癌中miRNA 的差异性表达  23-24
    2.3 乳腺癌相关基因表达与miRNA 调控  24-28
      2.3.1 乳腺癌细胞的分化、增值与凋亡  24-25
      2.3.2 乳腺癌的侵袭转移  25
      2.3.3 缺氧与耐药  25-26
      2.3.4 激素受体和细胞因子介导的信号转导通路  26-28
  3 血清miRNA 与肿瘤标记物  28-30
  4 研究肿瘤miRNA 的主要方法  30-37
    4.1 遗传学方法  30-31
    4.2 Northern 印记杂交(Nother Blot)  31
    4.3 基因芯片(miRNA microarray)  31
    4.4 real-time PCR  31-33
      4.4.1 real-time PCR 的原理  32
      4.4.2 real-time PCR 的特点  32-33
      4.4.3 real-time PCR 的应用  33
    4.5 miRNA 潜在靶标的预测  33-37
      4.5.1 生物信息学预测  34-35
      4.5.2 mRNA 表达芯片  35-37
第二章实验方案设计  37-39
  1 研究目的和意义  37
  2 研究主要内容  37-38
  3 实验流程图  38-39
第三章材料与方法  39-59
  1 材料  39-45
    1.1 乳腺组织与血清样本  39-40
    1.2 主要仪器及材料  40-41
    1.3 反转录茎环引物及PCR 引物  41-42
    1.4 试剂及其来源  42-45
  2 方法  45-59
    2.1 乳腺癌组织样本的免疫组化  45-46
    2.2 血清样本制备  46
    2.3 总RNA 样本制备  46-48
      2.3.1 乳腺组织总RNA 抽提  46-47
      2.3.2 乳腺血清总RNA 抽提  47
      2.3.3 总RNA 的定量和完整性检测  47-48
    2.4 目标miRNA 的筛选  48-49
    2.5 miRNA 茎环引物及PCR 引物设计  49-50
      2.5.1 引物设计方法与原则  49
      2.5.2 引物特异性的验证与分析  49-50
    2.6 miRNA 表达的检测和分析  50-57
      2.6.1 cDNA 第一链的合成（RT）  50-51
      2.6.2 PCR 反应  51-52
      2.6.3 PCR 产物加接头的连接反应  52
      2.6.4 连接产物回收、富集与纯化  52-53
      2.6.5 构建质粒载体的连接反应  53-54
      2.6.6 重组质粒转化  54-55
      2.6.7 重组质粒筛选与鉴定  55-56
      2.6.8 序列测定及分析  56-57
    2.7 miRNA 表达的定量分析  57-58
      2.7.1 cDNA 第一链的合成  57
      2.7.2 荧光定量PCR 过程  57-58
      2.7.3 数据处理及统计分析  58
    2.8 miRNA 潜在靶标的预测  58-59
第四章结果与分析  59-89
  1 乳腺癌组织样本的免疫组化分析  59
  2 总RNA 样本的质量分析  59-63
  3 miRNA 在乳腺组织和血清中表达的检测与分析  63-66
    3.1 miRNA 基因的扩增（RT-PCR）  63
    3.2 重组质粒的PCR 鉴定  63-64
    3.3 miRNA 基因的测序验证结果  64-65
    3.4 引物特异性的验证与分析  65-66
  4 乳腺肿瘤组织中miRNA 的差异性表达分析  66-70
    4.1 miRNA 在乳腺癌组织及其癌旁正常组织中表达的差异性分析  66-67
    4.2 miRNA 在乳腺组织中的表达在患病年龄上的差异性分析  67-68
    4.3 miRNA 在乳腺组织中的表达在病理分级上的差异性分析  68-69
    4.4 miRNA 在乳腺组织中的表达在激素受体表达量上的差异性分析  69-70
  5 血清中miRNA 的表达与性别的相关性  70-72
  6 乳腺肿瘤患者血清中miRNA 的差异性表达分析  72-76
    6.1 miRNA 在乳腺癌血清与正常血清中表达的差异性分析  73
    6.2 miRNA 在血清中的表达在患病年龄上的差异性分析  73-74
    6.3 miRNA 在血清中的表达在病理分级上的差异性分析  74-75
    6.4 miRNA 在血清中的表达在激素受体表达量上的差异性分析  75-76
  7 乳腺组织和血清中miRNA 表达的相似性分析  76-81
    7.1 患病年龄上的相似性分析  76-78
    7.2 病理分级上的相似性分析  78-80
    7.3 雌、孕激素受体表达量上的相似性分析  80-81
  8 miRNA 在血清和组织中表达的相关性分析  81
  9 miRNA 的差异性表达指示各病理特征  81-85
  10 miRNA 潜在靶标的预测结果  85-89
第五章讨论  89-94
  1 miRNA 作为乳腺肿瘤血清学分子标记物  89-91
    1.1 miRNA 作为乳腺癌分子标记物的意义  89
    1.2 miRNA 在血清中的稳定性与表达  89-90
    1.3 miRNA 在组织与血清中表达的相关性  90-91
  2 基于荧光定量PCR 技术检测血清miRNA  91-92
  3 目标miRNA 指示乳腺肿瘤病理特征  92-93
    3.1 目标miRNA 指示临床病理分级  92
    3.2 目标miRNA 指示激素受体表达量  92-93
  4 miRNA 及其潜在靶标研究意义  93-94
第六章总结与展望  94-96
参考文献  96-101
致谢  101-102
附录一重要试剂的配制  102-104

microRNA在乳腺肿瘤患者组织和血清中表达的变化和相关性

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