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油菜菌核病抗性相关基因的功能研究

作　者: 任秋红
导　师: 田保明；刘胜毅
学　校: 郑州大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘蓝型油菜 荧光定量PCR 菌核病 人工microRNA 防御反应
分类号: S435.654
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


油菜菌核病(Sclertinia sclerotiorum (Lib) de Bary)是一种世界性病害,各油菜生产国均有发生,历来深受科研人员的高度重视,从分子水平研究菌核病致病机理是油菜菌核病研究的一个重要方面。本研究以油菜抗病相关的Unigene库/cDNA文库及其芯片表达谱结果为基础,首先利用荧光定量PCR法验证cDNA芯片杂交结果中部分抗病相关基因表达模式。以此研究为依据,选择了3个与油菜抗菌核病相关的基因,构建干扰载体,从病原诱导表达测定、转基因功能鉴定的角度研究了这些基因的功能。初步结果表明基因AT-29、AT-30和AT-10与菌核病抗性相关,为油菜抗病相关基因。研究获得的主要结果如下：1. cDNA芯片验证。利用荧光定量PCR法验证cDNA芯片杂交结果中部分抗病相关基因表达模式。结果显示：Real time PCR检测结果与cDNA芯片杂交结果中基因的表达趋势基本一致,说明cDNA芯片结果可靠。2.通过amiRNA干扰技术鉴定油菜同源基因AT-29、AT-30和AT-10的功能。在基因功能研究中,人工miRNAs (artificial miRNAs, amiRNAs)干扰技术是一种新型的、高效的、高通量的基因沉默新技术,因此本文采用amiRNA技术鉴定基因Bn-29、Bn-30和Bn-10的功能。本研究基于油菜菌核病抗性相关基因芯片表达谱分析结果,选择了3个受菌核病特异诱导表达上调的基因Bn-29、Bn-30和Bn-10作为研究对象。根据这些侯选基因的拟南芥同源基因AT-29、AT-30和AT-10的序列,设计靶序列,通过overlapping PCR的方法构建amiRNA干扰载体；获得经PCR检测为阳性的转基因拟南芥。首先利用荧光定量PCR检测转基因植株中目的基因的表达,结果表明：导入amiRNAs干扰载体的转基因株系中,目的基因AT-29、AT-30和AT-10的表达量均显著降低,转基因植株中表达量均被抑制了近50%,最高抑制了88%,达到了理想的干扰效果。此外利用荧光定量PCR检测拟南芥转基因植株防御标记基因PDF1.2(茉莉酸信号传导途径标志基因)和PR1(水杨酸信号传导途径标志基因)的表达,结果显示：转基因植株中标记基因PDF1.2和PR1的表达量降低了近50%,最高降低了90%；AT-29、AT-30和AT-10转基因植株中基因PDF1.2和PRl的表达量均低于野生型。说明防御标记基因PDF1.2和PR1在转基因植株中显著降低。转基因植株活体接核盘菌鉴定表明,发现内源基因AT-29、AT-30和AT-10表达被显著干扰后,拟南芥对核盘菌的敏感性表现显著增强。以上结果说明了AT-29、AT-30和AT-10基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性密切相关。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章 综述  11-24
  1.1 菌核病菌的研究进展  11-16
    1.1.1 菌核病菌的生物学特性  11-12
    1.1.2 核盘菌的侵染和致病机理  12-14
    1.1.3 油菜抗菌核病的研究进展  14-16
  1.2 植物抗病反应机理  16-20
    1.2.1 水杨酸(salicylic acid,SA)依赖性的信号传导途径  17-18
    1.2.2 茉莉酸(Jasmonic acid,JA)/乙烯(ethylene)信号转导途径  18-20
  1.3 功能基因组学在植物抗病性研究中的应用  20-23
    1.3.1 人工microRNA干扰技术  20-21
    1.3.2 表达谱技术  21-22
    1.3.3 比较基因组学  22-23
  1.4 本研究的目的和意义  23-24
第2章 油菜防御cDNA芯片的验证  24-34
  2.1 材料  24-25
    2.1.1 植物和真菌材料  24
    2.1.2 主要试剂及引物合成  24-25
  2.2 方法  25-29
    2.2.1 化学诱导处理  25-26
    2.2.2 核盘菌活体接种  26
    2.2.3 取样  26
    2.2.4 RNA提取—Trizol提取  26-27
    2.2.5 DNA消化  27-28
    2.2.6 核酸浓度测定  28
    2.2.7 反转录  28
    2.2.8 Real time PCR  28-29
    2.2.9 数据处理  29
  2.3 结果与分析  29-32
    2.3.1 PCR条件优化和特异产物扩增  29-30
    2.3.2 Real time PCR与cDNA芯片结果分析  30-32
  2.4 讨论  32-34
第3章 防御相关基因功能初步研究  34-49
  3.1 材料  34-37
    3.1.1 植物材料  34-35
    3.1.2 试剂  35
    3.1.3 培养基  35-36
    3.1.4 荧光定量PCR引物合成  36-37
  3.2 方法  37-41
    3.2.1 重组质粒DNA转化农杆菌  37
    3.2.2 阳性克隆的菌液PCR鉴定  37-38
    3.2.3 拟南芥转化(花序浸染法)  38-39
    3.2.4 转基因拟南芥植株除草剂筛选  39
    3.2.5 转基因拟南芥植株PCR鉴定  39-40
    3.2.6 转基因拟南芥植株荧光定量PCR鉴定  40
    3.2.7 转基因拟南芥植株菌核病抗性鉴定  40-41
    3.2.8 油菜BN-29菌核病及化学激素诱导表达研究  41
  3.3 结果与分析  41-48
    3.3.1 转基因拟南芥植株获得及PCR鉴定  41
    3.3.2 转基因拟南芥植株目的基因的表达  41-43
    3.3.3 转基因拟南芥植株防御标记基因PDF1.2和PR1的表达  43-44
    3.3.4 转基因拟南芥植株活体抗病性鉴定  44-46
    3.3.5 油菜Bn-29核盘菌及化学激素诱导表达  46-48
  3.4 讨论  48-49
第4章 结论  49-51
参考文献  51-56
附录A  56-58
附录B  58-59
个人简历  59-60
致谢  60

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 油菜子（芸苔）病虫害
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