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应用双质粒体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中表达量的初步研究

作　者: 王慧
导　师: 许正宏
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: GLP-1 融合蛋白GGH 毕赤酵母原位杂交双膜法双质粒
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)具有刺激胰岛素的生物合成和分泌,促进胰腺β细胞的增殖并抑制其凋亡,抑制胰高血糖素的分泌等多种生理功能,有望成为治疗2型糖尿病的新药物,但是GLP-1在体内迅速被二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)降解,限制了其临床应用。为克服该缺点,本实验室前期通过重叠PCR将两个GLP-1突变串联体分子与一个人血清白蛋白HSA分子融合((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH),构建重组表达质粒pPIC9K-GGH,并实现了其在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达,得到一株高产菌GS115/F2。该融合蛋白GGH在患病小鼠体内不仅具有较好的降血糖和修复胰岛的功效,而且72 h在体内仍具有生物活性。为了实现转化子的高通量筛选,建立了一个高通量的筛选模型,即原位杂交双膜法。原位杂交双膜法是一种基于免疫学原理的快速筛选高表达毕赤酵母转化子的方法,首先将刚电转之后的转化子涂布在醋酸纤维素膜上,再利用硝酸纤维素膜原位捕获穿过醋酸纤维素膜的菌落分泌蛋白,然后用免疫方法检测与硝酸纤维素膜结合的蛋白,最后挑选显色深浅不一的菌落进行摇瓶培养,结果证明,原位双膜法所得的染色强度与该菌落液体诱导表达水平正相关。为了实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白GGH的规模化制备,本文通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-GGH,并电转至经载体pPIC9K-GGH异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用原位杂交双膜法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,于30℃,诱导浓缩比为3:1的条件下3%甲醇诱导80 h,融合蛋白GGH的表达量达到了491 mg/L,较GS115/F2提高了49.7%。通过荧光定量PCR发现GGH基因拷贝数在含有双质粒体系的GS115/F3中较出发菌株GS115/F2提高了26.7%。Western blotting杂交表明融合蛋白同时具有人血清白蛋白和人胰高血糖素样肽-1的抗原性。在5L发酵罐放大实验中,采用分批补料发酵,1%浓度的甲醇脉冲式诱导80 h后菌浓OD600达到了250左右,蛋白产量达到了800 mg/L以上。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-7
第一章绪论  7-13
  1.1 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的概况  7-8
    1.1.1 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的结构  7
    1.1.2 GLP-1 的生理功能  7
    1.1.3 GLP-1 的长效性研究进展  7-8
  1.2 毕赤酵母表达系统  8-11
    1.2.1 毕赤酵母  8-9
    1.2.2 毕赤酵母常用宿主和载体  9-10
    1.2.3 提高目标蛋白在毕赤酵母中产量的研究进展  10-11
  1.3 立题背景和研究内容  11-13
    1.3.1 立题背景  11-12
    1.3.2 研究内容  12-13
第二章原位杂交双膜法筛选目标蛋白高产菌的模型的建立  13-19
  2.1 材料  13-14
    2.1.1 仪器和设备  13
    2.1.2 主要试剂  13-14
    2.1.3 培养基  14
    2.1.4 菌株  14
  2.2 实验方法  14-17
    2.2.1 出发菌株GS115/F_2 发酵曲线的测定和形态学表征  14
    2.2.2 原位杂交双膜法筛选模型的建立  14-15
    2.2.3 毕赤酵母摇床上的诱导培养  15-16
    2.2.4 SDS-PAGE 的制作  16-17
  2.3 结果与讨论  17-18
    2.3.1 毕赤酵母生长曲线和形态学特征  17
    2.3.2 原位杂交双膜法筛选显色结果  17-18
    2.3.3 毕赤酵母GS115/F_2 摇瓶培养的参数测定  18
  2.4 本章小结  18-19
第三章毕赤酵母双质粒共表达体系的构建  19-31
  3.1 材料  20
    3.1.1 菌株和质粒  20
    3.1.2 试剂  20
    3.1.3 仪器和设备  20
    3.1.4 酶  20
  3.2 方法  20-26
    3.2.1 重组质粒pPIC9K-GGH 提取  20-21
    3.2.2 融合蛋白基因GGH 的扩增与回收  21-22
    3.2.3 目的基因和T-载体连接及转化  22-23
    3.2.4 阳性转化子的PCR 验证  23
    3.2.5 目的基因和表达载体pPICZαB 连接  23-24
    3.2.6 阳性转化子pPICZαB-GGH 的双酶切验证和测序  24
    3.2.7 线性化重组质粒pPICZαB-GGH  24-25
    3.2.8 毕赤酵母GS115/F_2 感受态的制备及电转化  25
    3.2.9 原位杂交双膜法结合高浓度抗生素筛选高产菌  25-26
  3.3 结果  26-29
    3.3.1 表达质粒pPICZαB-GGH 构建流程  26
    3.3.2 融合蛋白GGH 的基因扩增  26-27
    3.3.3 双酶切验证及pPICZαB-GGH 基因测序  27
    3.3.4 抗生素的浓度选择  27-28
    3.3.5 原位双膜法结合高抗生素筛选结果  28-29
  3.4 本章小结  29-31
第四章高产菌株与出发菌株的比较  31-43
  4.1 材料  31-32
    4.1.1 菌株  31
    4.1.2 试剂  31-32
    4.1.3 仪器和设备  32
  4.2 方法  32-36
    4.2.1 高产菌GS115/F_2 和出发菌株GS115/F_3 摇床诱导培养比较  32
    4.2.2 Western blotting 鉴定  32-33
    4.2.3 毕赤酵母基因组的提取  33
    4.2.4 常规PCR 验证二次重组菌  33-34
    4.2.5 定量PCR 检测融合蛋白基因GGH 拷贝数  34-35
    4.2.6 不同浓度的甲醇诱导毕赤酵母高产菌GS115/F_3 在5L 发酵罐的分析  35
    4.2.7 高产菌GS115/F_3 和出发菌株GS115/F_2 在5 L 罐上的生长及表达  35-36
  4.3 结果与讨论  36-42
    4.3.1 摇瓶比较高产菌株 GS115/F3 和出发菌株 GS115/F2 的生长曲线和融合蛋白产量  36-37
    4.3.2 融合蛋白GGH 的Western blotting 鉴定  37
    4.3.3 毕赤酵母基因组的提取  37-38
    4.3.4 PCR 验证二次重组菌  38
    4.3.5 定量PCR 结果  38-39
    4.3.6 不同浓度甲醇诱导毕赤酵母GS115/F_3 的菌体生长密度和蛋白表达水平  39-41
    4.3.7 毕赤酵母GS115  41-42
  4.4 本章小结  42-43
第五章结论与展望  43-45
  5.1 主要结论  43
  5.2 存在的问题  43-45
致谢  45-47
参考文献  47-51
附录一： GGH 序列比对结果  51-53
附录二：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  53-54

应用双质粒体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中表达量的初步研究

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