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苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究

作　者: 逯晋忠
导　师: 赵秀云；祁高富；喻子牛；陈京元
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 云斑天牛 生物测定 抗性检测 基因克隆
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究表明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)对鞘翅目害虫有较好的防治效果。为获得对鞘翅目天牛科害虫云斑天牛(Batocera horsfieldi (Hope))具有高毒力的Bt菌株,我们用本室所保存的504株苏云金芽胞杆菌对云斑天牛成虫进行了生物测定和抗虫机理方面的研究,结果如下：(1)高毒力菌株的筛选：通过一次初筛和两次复筛生物测定,筛选到一株对云斑天牛成虫有较高毒力的菌株ZQ-89。感染喂养20天后校正死亡率达到55.33%,校正体重减少率为2.22%,产卵减少率为19.62%。ZQ-89不仅对天牛有较高的抗性,而且对天牛的生长量和繁殖力都有较高的抑制作用。(2)ZQ-89抗虫机理的初步研究：从感染ZQ-89菌株死亡的天牛肠道中分离到苏云金芽胞杆菌FZQ-89,对其菌体、芽胞及晶体蛋白的形态进行观察,生测验证和16SrDNA鉴定后发现,FZQ-89与ZQ-89菌株具有极高的相似性,因此判断FZQ-89系ZQ-89感染天牛后在体内繁殖的子代菌株,由此推测苏云金芽胞杆菌可通过天牛取食进入其肠道而发挥抗虫作用。(3)ZQ-89杀虫活性成分的研究：发现在同等浓度下,纯晶体蛋白的杀虫活性最高。推测晶体蛋白在ZQ-89对云斑天牛成虫的抗性作用中起到了主要作用。检测晶体蛋白对天牛的抗性,计算出ZQ-89对天牛的致死中浓度LCso为21.961 mg/mL(4)ZQ-89菌株抗虫基因的克隆和序列分析：对ZQ-89所产晶体蛋白进行肽指纹图谱分析,发现其与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac类蛋白有较高的同源性。根据同源性蛋白设计引物,克隆到全长为3534 bp的抗性基因,命名为cry1Ac-89基因,编码1177个氨基酸。(5)ZAC-89工程菌的构建：将cry1Ac-89基因克隆到载体pHT304中,将其转入无晶体突变株BMB171中,对其所产晶体形状进行了观测,发现与ZQ-89相似,都是菱形；SDS-PAGE检测后发现,ZAC-89所产晶体蛋白大小和ZQ-89一样,都为133 kDa。推测ZAC-89可能与ZQ-89有相同的杀虫效果,在防治云斑天牛危害方面有着潜在的应用价值。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表  10-11
1 前言  11-25
  1.1 云斑天牛  11-17
    1.1.1 云斑天牛的形态特征及生物学特性  11-12
    1.1.2 云斑天牛的危害  12-13
    1.1.3 云斑天牛的寄主范围及地域分布  13-14
    1.1.4 云斑天牛的防治措施  14-17
      1.1.4.1 改造杨树种植方式和培育新品种  14-15
      1.1.4.2 物理防治方法  15
      1.1.4.3 化学防治方法  15
      1.1.4.4 生物防治方法  15-17
  1.2 苏云金芽胞杆菌  17-24
    1.2.1 苏云金芽胞杆菌生物学特性  17-18
    1.2.2 苏云金芽胞杆菌的杀虫活性成分  18-19
    1.2.3 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白及其编码基因  19-20
    1.2.4 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白基因的命名和分类  20-22
    1.2.5 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白作用机制  22-23
    1.2.6 苏云金芽胞杆菌防治鞘翅目害虫的研究状况  23-24
  1.3 研究的目的和意义  24-25
2 材料和方法  25-46
  2.1 材料  25-29
    2.1.1 菌株、质粒与供试昆虫  25
    2.1.2 培养基  25
    2.1.3 溶液  25-27
      2.1.3.1 常用溶液的配制  25-26
      2.1.3.2 SDS-PAGE相关溶液的配制  26-27
    2.1.4 所用试剂  27
      2.1.4.1 抗生素  27
      2.1.4.2 试剂  27
      2.1.4.3 试剂盒  27
    2.1.5 仪器  27-29
  2.2 方法  29-46
    2.2.1 云斑天牛成虫采集和饲养  29-30
      2.2.1.1 云斑天牛成虫的采集  29-30
      2.2.1.2 室内饲养方法  30
    2.2.2 生物测定  30-35
      2.2.2.1 苏云金芽胞杆菌菌悬剂的制备  30-31
      2.2.2.2 晶体蛋白粉剂、芽胞粉剂、胞晶混合物粉剂的制备  31
      2.2.2.3 初筛  31-32
      2.2.2.4 复筛  32
      2.2.2.5 从云斑天牛体内重新分离苏云金芽胞杆菌  32-33
      2.2.2.6 云斑天牛肠道分离菌株的生测验证和16SrDNA鉴定  33
      2.2.2.7 ZQ-89菌株杀虫活性成份的分析  33-34
      2.2.2.8 生测结果的分析方法  34-35
    2.2.3 ZQ-89菌株形态观察及晶体蛋白的分析  35-36
      2.2.3.1 ZQ-89菌株形态观察  35
      2.2.3.2 ZQ-89菌株晶体蛋白的分析  35-36
    2.2.4 ZQ-89菌株质粒和总DNA的制备  36-37
      2.2.4.1 ZQ-89菌株质粒的抽提  36
      2.2.4.2 ZQ-89菌株总DNA的抽提  36-37
    2.2.5 ZQ-89菌株抗虫基因的克隆及序列分析  37-39
      2.2.5.1 Cry1Ac-89基因的克隆  37-38
      2.2.5.2 抗虫基因cry1Ac-89的TA克隆及测序  38
      2.2.5.3 Cry1Ac-89基因和蛋白质氨基酸序列的分析  38-39
    2.2.6 ZQ-89菌株中含启动子cry1Ac-89基因片段的扩增  39-41
      2.2.6.1 反向PCR(inversePCR)法扩增cry1Ac-89基因的启动子  39-40
      2.2.6.2 含启动子的cry1Ac-89基因片段的扩增  40-41
    2.2.7 pHT304-Ac89载体的构建  41-43
      2.2.7.1 大肠杆菌E. coli DH5 α的质粒抽提  41-42
      2.2.7.2 含启动子cry1Ac-89基因片段和质粒pHT304的双酶切与连接  42-43
      2.2.7.3 pHT304-Ac89转化大肠杆菌E. coli DH5 α并验证  43
    2.2.8 工程菌ZAC-89构建  43-44
      2.2.8.1 pHT304-Ac89载体DNA去盐  43-44
      2.2.8.2 pHT304-Ac89转化BMB171  44
    2.2.9 工程菌ZAC-89的基本特征  44-46
      2.2.9.1 ZAC-89菌体和伴胞晶体形态观察  44
      2.2.9.2 ZAC-89伴胞晶体产生过程观察  44-45
      2.2.9.3 ZAC-89晶体蛋白SDS-PAGE检测  45-46
3 结果与分析  46-70
  3.1 生物测定结果  46-61
    3.1.1 初筛结果  46-50
    3.1.2 复筛结果及分析  50-54
      3.1.2.1 第一次复筛  50-52
      3.1.2.2 第二次复筛  52-54
    3.1.3 FZQ-89的分离、生测验证和16SrDNA鉴定  54-57
      3.1.3.1 FZQ-89的分离与形态观察  54-56
      3.1.3.2 FZQ-89菌株的生测验证  56-57
      3.1.3.3 FZQ-89菌株的16SrDNA鉴定  57
    3.1.4 ZQ-89抗虫活性成分分析  57-61
      3.1.4.1 ZQ-89菌株抗虫活性成分确定  57-59
      3.1.4.2 ZQ-89菌株晶体蛋白抗虫活性分析  59-61
  3.2 ZQ-89菌株晶体蛋白的分析  61-63
    3.2.1 ZQ-89菌株晶体蛋白SDS-PAGE检测  61-62
    3.2.2 ZQ-89菌株晶体蛋白的肽指纹图谱分析  62-63
  3.3 ZQ-89菌株质粒和基因组DNA的提取  63-64
  3.4 ZQ-89抗虫基因的克隆及分析  64-65
    3.4.1 Cry1Ac-89基因的克隆  64
    3.4.2 ZQ-89菌株cry1Ac-89基因及蛋白序列的分析  64-65
  3.5 工程菌ZAC-89的构建  65-66
  3.6 工程菌ZAC-89基本特征  66-70
    3.6.1 ZAC-89菌体及伴胞晶体形态观察  66-67
    3.6.2 ZAC-89伴胞晶体产生过程观察  67-68
    3.6.3 ZAC-89晶体蛋白SDS-PAGE检测  68-70
4 讨论  70-72
参考文献  72-79
致谢  79-80
附录Ⅰ  80-85
附录Ⅱ  85-86
附录Ⅲ  86

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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