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家蚕30kD载脂蛋白19G1的表达和功能的初步研究

作　者: 陈晓平
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 30K蛋白 低分子量30kD载脂蛋白19G1 RT-PCR
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


30K蛋白家族是一类在氨基酸组成及免疫学活性上相似的蛋白,分子量约为30 kD[1,2]。家蚕30K蛋白是由脂肪体合成的非雌特异性脂蛋白,表达受保幼激素的调节,是生长发育过程中主要储藏蛋白之一,是五龄幼虫及蛹主要的蛋白组分,主要分布在血淋巴中[3]。对雌性家蚕,30K蛋白还是卵黄原蛋白的重要组成部分[3]。30K蛋白中研究比较多的是30 kD载脂蛋白6G1和19G1。Kim EJ[1]与Park HJ[4]分别把家蚕30Kc6基因构建入表达载体在大肠杆菌中表达得到重组蛋白,纯化后添加到哺乳动物及昆虫细胞培养基中,能抑制哺乳动物及昆虫细胞的凋亡;Koo TY[5]等构建了表达重组30Kc6基因的生产干扰素的CHO细胞系,结果表明30Kc6基因的表达抑制细胞的凋亡并提高干扰素的产量。本研究从家蚕蛹cDNA文库中通过生物信息学分析发现一条低分子量30 kD载脂蛋白19G1前体（low molecular mass 30 kD lipoprotein 19G1 precursor）的EST序列（GenBank登录号:AY568957）。生物信息学分析结果表明该基因ORF不含内含子,由长为771 bp的单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量约为29.5 kD,等点电为7.290。我们将其ORF克隆到原核表达载体pET-28a（+）中,构建重组质粒,双酶切鉴定及序列测定正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在,经过镍柱亲和层析纯化后获得高纯度的目的蛋白,以该重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测,抗体效价可达1:12800,Western blotting结果显示抗体的特异性较好。提取家蚕各个时期和五龄幼虫各组织的总RNA分别进行荧光定量PCR分析结果表明,家蚕发育时期在蛹期转录水平最高,卵中最低;五龄幼虫时期在脂肪体中转录水平较高,丝腺和肠较低。提取家蚕各发育时期以及家蚕五龄幼虫各组织蛋白进行Western blotting分析,结果表明,该蛋白在家蚕蛹中及五龄幼虫的脂肪体、卵巢表达较高。把纯化的蛋白添加到家蚕Bm5细胞培养基中,结果表明重组30 kD载脂蛋白19G1能抑制化学试剂（地塞米松）诱导的家蚕Bm5细胞的凋亡。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-11
缩略语  11-12
第一章 家蚕30KD 载脂蛋白的研究进展  12-18
  1 前言  12
  2 30KC19 基因及编码蛋白结构的研究进展  12-13
  3 家蚕30KD 脂蛋白（6G1 和19G1）抗真菌的研究进展  13-14
    3.1 天然家蚕30kD 脂蛋白（6G1 和19G1）抗真菌的研究进展  13-14
    3.2 重组30kD 脂蛋白（6G1 和19G1）（大肠杆菌表达）抗真菌的研究进展  14
  4 30K 蛋白抑制凋亡作用的研究进展  14-17
    4.1 天然家蚕30kD 脂蛋白抑制凋亡作用的研究进展  14-15
    4.2 细胞过量表达家蚕30K 蛋白抑制凋亡作用的研究进展  15-16
    4.3 重组家蚕30kD 脂蛋白抑制凋亡作用的研究进展  16
    4.4 30K 蛋白抑制凋亡作用在生物制药工程中的应用  16-17
  5 研究展望  17-18
第二章 实验方案设计  18-20
  1 研究目的和意义  18
  2 研究内容  18-19
  3 实验流程  19-20
第三章 生物信息学分析  20-28
  1 材料  20
  2 方法  20-21
    2.1 30Kc19 基因的获得  20
    2.2 30Kc19 基因的分析方法  20-21
  3 结果  21-26
    3.1 30Kc19 基因的序列分析  21
    3.2 30Kc19 基因的结构分析  21-22
    3.3 低分子量家蚕30kD 载脂蛋白19G1 前体的疏水性分析  22
    3.4 低分子量家蚕30kD 载脂蛋白19G1 前体的跨膜分析  22-23
    3.5 低分子量家蚕30kD 载脂蛋白19G1 前体的信号肽分析  23-24
    3.6 低分子量家蚕30kD 载脂蛋白19G1 前体定位的预测  24
    3.7 家蚕低分子量30kD 载脂蛋白19G1 前体基因推测的氨基酸同源性分析  24-25
    3.8 家蚕低分子量30kD 载脂蛋白19G1 前体的进化树分析  25-26
  4 讨论  26-28
第四章 家蚕30KC19 基因的原核表达  28-44
  1 材料与试剂  28-31
    1.1 材料  28
    1.2 试剂  28
    1.3 主要试剂的配制  28-31
  2 方法  31-40
    2.1 家蚕蛹体基因组DNA 的制备方法[50]  31-32
    2.2 家蚕30Kc19 基因的克隆  32-36
    2.3 重组克隆的筛选与鉴定  36-38
    2.4 重组质粒的转化及鉴定  38
    2.5 重组质粒在大肠杆菌中的表达  38
    2.6 SDS-PAGE 电泳分析  38-40
  3 结果  40-43
    3.1 30Kc19 基因与基因组序列比对结果  40
    3.2 家蚕蛹基因组DNA 提取结果  40-41
    3.3 目的基因PCR 扩增结果  41
    3.4 重组质粒的鉴定  41-42
    3.5 重组质粒测序结果  42
    3.6 30Kc19 基因的诱导表达  42-43
  4 讨论  43-44
第五章 重组蛋白的纯化及多克隆抗体的制备和鉴定  44-60
  1 试剂和材料  44-48
    1.1 材料  44
    1.2 试剂  44-45
    1.3 试剂配制  45-48
  2 方法  48-54
    2.1 表达产物的存在形式的检测  48
    2.2 重组菌株的保存  48
    2.3 重组质粒的保存  48-49
    2.4 包涵体的溶解与复性  49-50
    2.5 镍柱层析  50-51
    2.6 Bradford 检测蛋白浓度  51
    2.7 抗体的制备  51-54
    2.8 融合蛋白的Western blotting 鉴定  54
  3 结果  54-58
    3.1 表达产物的存在形式  54-55
    3.2 表达蛋白纯化结果  55-56
    3.3 抗体的纯化  56-57
    3.4 多克隆抗体的效价测定  57
    3.5 Western blotting 检测结果  57-58
  4 讨论  58-60
第六章 表达时序研究  60-69
  1 材料与试剂  60-61
    1.1 材料  60
    1.2 试剂  60
    1.3 试剂的配制  60-61
  2 方法  61-64
    2.1 总RNA 的提取  61-62
    2.2 cDNA 第一链的合成  62
    2.3 荧光定量PCR 引物的设计  62
    2.4 荧光定量PCR  62-63
    2.5 荧光定量PCR 数据分析  63
    2.6 总蛋白质的提取及定量  63
    2.7 Western blotting 检测30 kD 载脂蛋白19G1 的分布  63-64
  3 结果  64-68
    3.1 家蚕发育过程中mRNA 量的变化  64-65
    3.2 家蚕发育过程中30 kD 载脂蛋白19G1 表达量的变化  65-66
    3.3 五龄幼虫各组织中mRNA 量的比较  66-68
    3.4 五龄幼虫各组织中30 kD 载脂蛋白19G1 表达量的比较  68
  4 讨论  68-69
第七章 功能的初步研究  69-73
  1 试剂和材料  69
    1.1 材料  69
    1.2 试剂  69
  2 方法  69-71
    2.1 家蚕细胞的培养  69-70
    2.2 家蚕血清的收集及预处理  70
    2.3 制备新鲜的表达30 kD 载脂蛋白19G1 的大肠杆菌裂解液  70
    2.4 向细胞培养基中添加成分  70
    2.5 凋亡诱导  70
    2.6 家蚕Bm5 细胞存活率的测定  70-71
  3 结果  71-72
  4 讨论  72-73
结论与展望  73-75
  结论  73
  展望  73-75
参考文献  75-78
致谢  78

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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