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虫草素、普伐他汀对肿瘤坏死因子α诱导大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4蛋白表达的影响

作　者: 张宇
导　师: 欧阳平
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: syndecan-4 虫草素 普伐他汀 肿瘤坏死因子α 血管平滑肌细胞 细胞增殖
分类号: R543
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是导致心血管疾病的重要原因之一。日益增多的证据表明,动脉粥样硬化是一个对血管损伤的过度炎症反应。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和表型改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的主要病理基础之一。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是炎症反应的关键调节因子之一,可从多种不同的炎症细胞中释放,在动脉粥样硬化发生发展中起着关键的作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。Syndecan-4在多种细胞均有表达,它在非哺乳动物中的主要作用是促进神经系统的发育,在哺乳动物中调控着多种细胞生物学效应,在细胞的伸展、识别、粘附、迁移和增殖控制中扮演着重要的角色,同时也介导炎症反应。虫草素(cordycepin)即3’-脱氧腺苷,为含氮配糖体的核酸衍生物,为冬虫夏草的主要药理活性成分之一,既往的研究表明,虫草素具有抗炎和免疫调节等作用；目前包括普伐他汀在内的他汀类药物已经成为冠心病治疗的基石,它通过竞争性抑制胆固醇合成的限速3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA),从而降低胆固醇的合成。然而,他汀类药物具有不依赖于其降血脂特性的抗炎功效,能抑制许多炎症因子的表达和降低许多血清炎症标志物,对炎症反应过程各阶段均有抑制作用。目的分别以虫草素(cordycepin)和普伐他汀(pravastatin)为研究对象,通过体外培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,了解虫草素和普伐他汀对TNF-a诱导的大鼠胸主动脉VSMCs细胞syndecan-4蛋白表达的影响,进一步从细胞和分子水平上阐述syndecan-4蛋白在动脉粥样硬化发生发展中的作用。方法1.细胞增殖的检测：实验一：应用96孔板体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素、20μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时。每组浓度设6个副孔,同样实验条件重复6次,每组共36例实验数据,并设立对照组进行比较,采用MTS／PMS法确定大鼠胸主动脉VSMCs的增殖状态。实验二：应用96孔板体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时。每组浓度设13个副孔,同样实验条件重复2次,每组共26例实验数据,并设立对照组进行比较,采用MTS/PMS法确定SD大鼠胸主动脉VSMCs的增殖状态。2. Syndecan-4蛋白表达的检测：实验一：体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素、20μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blotting蛋白免疫印迹法测定大鼠胸主动脉平滑肌细胞syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共3例实验数据,并设立对照组进行比较。实验二：体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、10μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blotting蛋白免疫印迹法测定大鼠胸主动脉平滑肌细胞syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共3例实验数据,并设立对照组进行比较。结果1、虫草素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响MTS/PMS法测定各组细胞增殖率分别为：对照组0.666±0.098, TNF-α20ng/mL组1.014±0.149,20μmol/mL虫草素组0.660±0.097,40μmol/mL虫草素组0.676±0.085, TNF-α20ng/mL联用20μmol/mL虫草素组0.662±0.107, TNF-α20ng/mL联用40μmol/mL虫草素组0.627±0.135。统计分析结果表明,与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05),而20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无显著影响(P>0.05)),20μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α,40μmol/mL虫草素联用20ng/ml TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对VSMCs增殖均有显著的抑制作用(P<0.05)。2、虫草素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1,其余各组syndecan-4蛋白表达量分别为：TNF-α20ng/mL组1.375±0.017,20μmol/mL虫草素组1.009±0.112,40μmol/mL虫草素组1.002±0.051, TNF-α20ng/mL+20μmol/mL虫草素组0.962±0.057, TNF-α20ng/mL+40μmol/mL虫草素0.914±0.057(如图2)。统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表达(P<0.05)；而虫草素不同剂量组单独应用对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均无显著作用(P>0.05). TNF-α联合虫草素共同作用组与TNF-α组比较对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均有显著抑制作用(P<0.05)。3、普伐他汀对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响MTS/PMS法测定各组细胞增殖率分别为：对照组0.625±0.133, TNF-α20ng/mL组1.069±0.146,10μmol/mL普伐他汀组0.635±0.134,20μmol/mL普伐他汀组0.651±0.134, TNF-α20ng/mL联用10μmol/mL普伐他汀组0.684±0.128,TNF-α20ng/mL联用20μmol/mL普伐他汀组0.630±0.145。统计分析结果表明,与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05),而10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无显著影响(P>0.05).10μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀联用20ng/ml TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对VSMCs增殖均有显著的抑制作用(P<0.05)。4、普伐他汀对TNF-a诱导的VSMCS细胞syndecan-4蛋白表达的影响以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1,其余各组syndecan-4蛋白表达量分别为：TNF-α20ng/mL组1.340±0.050,10μmol/mL普伐他汀组1.023±0.035,20μmol/mL普伐他汀组1.010±0.072, TNF-α20ng/mL+10μmol/mL普伐他汀组0.967±0.038, TNF-α20ng/mL+20μmol/mL普伐他汀0.923±0.038。统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表达(P<0.05)；而普伐他汀不同剂量组单独应用对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均无显著作用(P>0.05)。TNF-α联合普伐他汀共同作用组与TNF-α组比较对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均有显著抑制作用(P<0.05)。结论综上所述,本研究证明了一定剂量的虫草素和普伐他汀能够显著抑制TNF-α诱导的大鼠VSMC增殖和syndecan-4蛋白表达。因此,有必要进一步研究虫草素和普伐他汀抑制syndecan-4蛋白表达的相关潜在靶点,为动脉粥样硬化的防治提供一定的实验依据。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-14
前言  14-22
第一部分 虫草素对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响  22-44
  材料和方法  22-34
  结果  34-37
  讨论  37-43
  结论  43-44
第二部分 普伐他汀对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响  44-60
  材料和方法  44-52
  结果  52-55
  讨论  55-59
  结论  59-60
全文总结  60-61
创新、展望与不足  61-62
参考文献  62-68
主要缩略词表  68-69
综述一  69-76
综述二  76-87
论文发表情况  87-88
致谢  88-91
统计学证明  91

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病
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