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金花茶体胚调控及SERK基因的克隆与定量表达分析

作　者: 强风风
导　师: 赖钟雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 金花茶 体胚发生 花状多子叶形胚 SERK 基因克隆 实时荧光定量PCR
分类号: S685.14
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究以金花茶成年茎段诱导的胚性培养物为材料,进行体胚发生同步化调控和花状多子叶形胚增殖系统的优化;克隆金花茶体胚SERK基因,并采用实时荧光定量PCR技术进行金花茶体胚发生过程中SERK基因转录水平表达变化研究。主要研究结果如下:1金花茶体胚发生同步化调控与花药胚性愈伤组织的诱导以金花茶成年茎段诱导的胚性培养物为材料,进行体胚发生同步化调控,结果表明:在C1:MS+4%蔗糖+2%山露醇+6%琼脂和C2:MS+4%蔗糖+2%甘露醇+6%琼脂培养基上获得球形胚和心形胚同步化材料,在人为挑选和培养基调控相结合的基础上,获得子叶胚和成熟胚材料。同时,进行了金花茶花药愈伤组织诱导。结果表明:金花茶花蕾低温4℃预处理24h,接种于MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1KT能诱导出愈伤组织,之后挑选愈伤组织接种到分化培养基MS+1.5 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IAA可观察到白色愈伤组织分化为绿色的生长点,经过筛选和形态学观察初步判断为胚性愈伤组织。2金花茶花状多子叶形胚增殖系统的优化本试验研究了不同浓度甜菜碱、PEG6000、激素组合对花状多子叶形胚的诱导影响。结果表明:在0.8 g·L-1甜菜碱+20 g·L-1甘露醇的MS培养基上,心形胚诱导花状多子叶形胚的效果最好,达到了86.6%。同时还促进次生胚的增殖;在PEG60007.5%+20 g·L-1甘露醇培养基上,花状子叶胚的诱导率最高,达到76.9%。从以上调控培养基上诱导的花状多子叶形胚中挑选较成熟的体胚转移至Y0培养基(1/2MS+NAA 0.2mg/L+BA 2mg/L),体胚由黄色转变为红色,最后在变红的胚体表面又生长出较同步的次生胚。将其重新接种到原来培养基上,培养40 d后就可以获得花状多子叶胚,可重复这一发育途径。3金花茶体胚SERK基因克隆以金花茶球形胚为材料,进行SERK基因克隆。根据其他植物已知SERK基因序列设计引物,应用同源克隆结合RACE技术,获得了金花茶体胚SERK基因cDNA的保守区和3’序列。该目的片段经测序得到的长为1219bp,该序列与登录GenBank其他植物SERK基因序列进行核苷酸比对发现,同源性85%-73%左右;经分析后发现金花茶体胚SERK基因编码277个氨基酸,与GenBank其他植物SERK基因序列进行氨基酸序列比对,同源性较高。这也证明了金花茶体胚SERK基因存在保守性。4金花茶体胚发生过程中SERK基因表达的实时荧光定量PCR分析本研究以18S rRNA作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析了金花茶体胚发生过程中SERK基因转录水平表达变化。结果表明:金花茶体胚发生过程中SERK基因都有不同程度的表达,其中子叶胚SERK基因表达量最大;成熟胚和花状多子叶形胚次之,球形胚和心形胚最小。这表明SERK基因的表达与金花茶子叶胚形成密切相关。

全文目录


目录  5-8
缩写词  8-10
摘要  10-11
Abstract  11-13
第一章 引言  13-23
  1 植物体细胞胚胎发生研究进展  14-17
    1.1 植物体细胞胚胎发生的意义  14
    1.2 渗透调节物质在体细胞胚胎发生中的作用  14-15
    1.3 植物体胚发生相关基因克隆及其功能的研究  15-16
    1.4 SERK 基因克隆研究进展  16-17
  2 实时荧光定量PCR 技术及其在基因表达定量分析研究中的作用  17-20
    2.1 荧光定量PCR 技术的原理及方法  17-18
      2.1.1 荧光定量PCR 主要原理  17-18
      2.1.2 分类  18
    2.2 荧光定量PCR 技术的研究进展  18-20
  3 金花茶离体培养的研究进展  20-21
    3.1 种胚的离体培养  20
    3.2 芽苗增殖和生根培养  20
    3.3 体胚发生的诱导和培养成苗  20-21
      3.3.1 金花茶的体胚发生  20-21
      3.3.2 花状子叶胚的发生  21
  4 本研究意义及主要内容  21-23
    4.1 研究意义  21-22
    4.2 研究内容  22-23
第二章 金花茶花药胚性愈伤组织诱导及体胚发生的调控  23-37
  第一节 金花茶花药胚性愈伤组织培养  23-28
    1 材料与方法  23-24
      1.1 接种材料  23-24
      1.2 培养方法  24
    2 结果与分析  24-26
      2.1 不同消毒时间对金花茶花药污染和死亡的影响  24
      2.2 低温预处理对花药愈伤组织诱导的影响  24-25
      2.3 激素对金花茶花药愈伤组织诱导的影响  25-26
      2.4 激素对花药愈伤组织分化的影响  26
    3 讨论  26-28
      3.1 花药采集时间对愈伤组织诱导的作用  26
      3.2 低温预处理对花药愈伤组织诱导的作用  26-27
      3.3 激素对花药愈伤组织诱导的作用  27
      3.4 激素对花药愈伤组织分化成体细胞的作用  27-28
  第二节 金花茶体胚同步化材料的培养  28-30
    1 材料与方法  28
      1.1 接种材料  28
      1.2 培养方法  28
        1.2.1 金花茶体胚的继代与增殖  28
        1.2.2 花状多子叶胚的继代与增殖  28
        1.2.3 金花茶离体苗的继代与增殖  28
    2 结果与分析  28-30
      2.1 金花茶体胚的继代与增殖  28-29
      2.2 金花茶球形胚、心形胚同步化材料的培养  29
      2.3 金花茶子叶胚和成熟胚同步化材料的培养  29
      2.4 金花茶离体再生苗的继代与增殖  29-30
    3 讨论  30
  第三节 金花茶花状多子叶形胚发生的调控  30-37
    1 材料与方法  31-32
      1.1 材料  31
      1.2 培养方法  31-32
        1.2.1 不同甜菜碱浓度对金花茶花状多子叶形胚的诱导  31
        1.2.2 不同浓度PEG6000 对金花茶花状多子叶形胚的诱导  31-32
        1.2.3 激素对金花茶花状多子叶形胚的诱导  32
      1.3 培养条件  32
    2 结果与分析  32-35
      2.1 甜菜碱对金花茶花状多子叶形胚的诱导影响  32-33
      2.2 PEG6000 对金花茶花状多子叶形胚的诱导影响  33-34
      2.3 激素对金花茶花状多子叶形胚的诱导影响  34-35
      2.4 金花茶花状多子叶形胚的继代和增殖  35
    3 讨论  35-37
      3.1 甜菜碱在金花茶花状多子叶形胚诱导中的作用  35
      3.2 PEG6000 在金花茶花状多子叶形胚诱导中的作用  35-36
      3.3 激素在金花茶花状多子叶形胚诱导中的作用  36-37
第三章 金花茶体胚SERK 基因克隆  37-50
  第一节 金花茶体胚RNA 的提取  37-39
    1 材料与方法  37-38
      1.1 供试材料  37
      1.2 试剂  37-38
      1.3 Trizol 提取法  38
    2 结果与分析  38-39
    3 讨论  39
  第二节 金花茶SERK 基因cDNA 序列的获得和序列分析  39-50
    1 材料和试剂  39-43
      1.1 供试材料  39-40
      1.2 仪器与试剂  40
      1.3 方法  40-43
        1.3.1 SERK 基因保守区克隆  40-41
        1.3.2 SERK 基因 3’race 的克隆  41-42
        1.3.3 PCR 产物的回收纯化  42-43
        1.3.4 PCR 片段的连接与转化  43
        1.3.5 序列测定  43
        1.3.6 序列比较  43
        1.3.7 序列拼接  43
    2 结果与分析  43-49
      2.1 金花茶体胚 SERK 基因的保守区克隆  43-44
      2.2 金花茶体胚SERK 基因的cDNA 的3′RACE 克隆结果  44-45
      2.3 金花茶体胚SERK 基因的cDNA 序列拼接结果  45-46
      2.4 金花茶SERK 基因核苷酸序列同源性比较  46
      2.5 金花茶SERK 基因序列分析及氨基酸序列同源性比较  46-48
      2.6 金花茶体胚SERK 基因的进化树分析  48-49
    3 讨论  49-50
      3.1 SERK 基因在体胚发生中的重要作用  49
      3.2 金花茶SERK 基因cDNA 序列获得的意义  49-50
第四章 金花茶体胚发生过程中SERK 基因表达实时荧光定量PCR 分析  50-60
  1 材料和方法  50-52
    1.1 材料  50
    1.2 试剂和仪器  50
    1.3 方法  50-52
      1.3.1 总RNA 提取和cDNA 合成  50-51
      1.3.2 引物设计  51
      1.3.3 实时荧光定量PCR 条件优化和实时定量分析  51-52
  2 结果与分析  52-58
    2.1 金花茶体胚发生过程中不同阶段的培养物总RNA 提取  52
    2.2 荧光实时PCR 扩增参照基因和SERK 基因的参数分析  52-57
      2.2.1 标准曲线绘制  52-55
      2.2.2 金花茶体胚发生过程中SERK 基因相对定量表达分析  55-57
    2.3 金花茶体胚发生过程中SERK 基因相对定量表达分析  57-58
  3 讨论  58-60
第五章 小结  60-63
参考文献  63-70
图版及图版说明  70-77
附录  77-93
致谢  93

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木） > 观花树木类 > 山茶
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