学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

亮氨酸调节自噬的信号通路研究

作　者: 朱娅琴
导　师: 马立保；晏向华
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 自噬亮氨酸 mTOR Rheb Raptor HEK 293T细胞
分类号: S852.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 162次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本试验旨在研究亮氨酸对细胞自噬水平的调节,及其调节是否依赖雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路,以及亮氨酸的信号传递到自噬相关蛋白是否必须通过mTOR上游调节蛋白中的Rheb、Raptor或GβL,为开展营养素感应的信号通路的深入研究提供策略。本试验主要包括三部分：(1)培养人胚肾细胞(HEK 293T),进行时间梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饥饿后透射电镜观察是否产生自噬泡及其产生的规律,并运用western blot方法检测LC3-Ⅱ和p62的表达丰度变化规律。将LC3-GFP表达质粒转染至HEK 293T细胞中表达,对细胞进行时间梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饥饿后共聚焦显微镜观察荧光分布规律。(2)在0.5h,1h,2h,4h中选取自噬最明显的两个时间点(2h,4h),将细胞进行亮氨酸饥饿,以及有、无雷帕霉素(RAPA)存在条件下亮氨酸饥饿后重新补充亮氨酸,分别检测LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表达丰度。(3)运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术分别干扰nTOR信号通路中的Rheb、Raptor或GβL表达后,在0.5h,1h,2h,4h中选取自噬最明显的两个时间点(2h,4h),将细胞进行亮氨酸饥饿及饥饿后重补充,检测LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表达丰度。研究结果如下：(1)亮氨酸饥饿0h的细胞未观察到自噬泡,LC3-GFP的荧光弥散分布于整个细胞胞浆。亮氨酸饥饿0.5h即产生了自噬泡,LC3-GFP的荧光也由弥散分布于胞浆转变为部分聚集状态。在4h内,自噬泡和LC3-GFP的荧光聚集程度随亮氨酸饥饿时间延长而增加,4h达到顶峰。Oh未检测到LC3-Ⅱ的表达,p62的表达量是所有时间点中最高的。亮氨酸饥饿0.5h后,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P<0.01),p62的表达丰度呈极显著降低(P<0.01)。在4h内,随亮氨酸饥饿时间延长,LC3-Ⅱ的表达丰度呈逐渐增加趋势,4h最多；p62的表达丰度呈逐渐降低趋势,4h最少。(2)亮氨酸饥饿2h后,相对于Oh对照组,LC3-Ⅱ的表达丰度均呈极显著增加(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P<0.01)。无RAPA存在时亮氨酸饥饿2h时重新补充亮氨酸,相对于饥饿0h组,LC3-Ⅱ和p62的表达丰度变化均不显著(P>0.05),pS6K1的表达丰度呈极显著降低(P<0.01)。相对于饥饿2h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著降低(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著增加(P<0.01)。有RAPA存在时亮氨酸饥饿2h后重新补充亮氨酸,相对于0h组和无RAPA存在时补充亮氨酸组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P<0.01)。相对于亮氨酸饥饿2h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度变化均不显著(P>0.05)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。(3)干扰Rheb或Raptor后,亮氨酸饥饿2h与饥饿后重新补充的结果相同。相对于0h组,LC3-Ⅱ的表达丰度均呈极显著增加(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P<0.01)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。干扰GβL后,相对于Oh组,亮氨酸饥饿2h时,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P<0.01)。干扰GβL后重新补充亮氨酸,相对于0h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著降低(P<0.01)。相对于饥饿2h组,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著降低(P<0.01),p62和pS6K1的表达丰度均呈极显著增加(P<0.01)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。本试验研究结果表明,亮氨酸饥饿能诱导细胞产生自噬,且自噬在一定时间内随饥饿时间的延长而加剧。重新补充亮氨酸能缓解自噬,并且这种缓解作用依赖于mTOR信号通路。Rheb和Raptor是mTOR上游调节蛋白中传递亮氨酸信号的关键因子,是连接亮氨酸和细胞自噬的串联桥梁。GβL不是亮氨酸信号传递至自噬所必需的。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语表 (Abbreviation)  10-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 自噬研究进展  12-17
    1.1.1 自噬的概念  12-13
    1.1.2 自噬相关信号通路  13-14
    1.1.3 自噬的特征及检测方法  14-17
  1.2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白研究进展  17-18
    1.2.1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的概念  17
    1.2.2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白相关信号通路  17-18
  1.3 支链氨基酸  18-19
  1.4 人胚肾细胞-293T  19-20
  1.5 RNA干扰  20
  1.6 本研究的目的和意义  20-22
第二章材料与方法  22-35
  2.1 试验材料  22-26
    2.1.1 细胞、菌种、载体与质粒  22-23
    2.1.2 主要药品及试剂  23
    2.1.3 主要培养基及其配制  23-24
    2.1.4 缓冲液  24-26
  2.2 试验方法  26-35
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  26
    2.2.2 干扰质粒的构建  26
    2.2.3 质粒的转化  26-27
    2.2.4 质粒的小量制备(改良的碱裂解法)  27
    2.2.5 质粒的大量制备(试剂盒)  27-28
    2.2.6 限制性内切酶酶切反应  28-29
    2.2.7 质粒提取产物或酶切产物的电泳检测  29
    2.2.8 人胚肾细胞的培养  29-30
    2.2.9 质粒转染细胞  30-31
    2.2.10 BCA法测定蛋白质浓度  31
    2.2.11 SDS-PAGE/western Blot  31-33
    2.2.12 流式细胞术  33
    2.2.13 透射电镜技术  33
    2.2.14 共聚焦显微镜技术(爬片法)  33-34
    2.2.15 统计学方法  34-35
第三章结果与分析  35-52
  3.1 质粒小量制备后鉴定  35
    3.1.1 质粒小量制备后电泳鉴定  35
    3.1.2 质粒小量制备后酶切鉴定  35
  3.2 质粒大量制备后鉴定  35-38
    3.2.1 质粒大量制备后浓度与纯度测定  35
    3.2.2 质粒大量制备后电泳及酶切鉴定  35-38
  3.3 干扰效率鉴定  38-41
    3.3.1 转染后荧光显微镜观察细胞荧光  38-39
    3.3.2 转染后流式细胞术检测荧光细胞率  39-40
    3.3.3 干扰后western blot检测被干扰蛋白的干扰效率  40-41
  3.4 亮氨酸饥饿  41
    3.4.1 透射电镜观察自噬泡的产生  41
    3.4.2 共聚焦显微镜观察LC3-GFP表达质粒的荧光分布  41
    3.4.3 亮氨酸饥饿后western blot检测自噬相关蛋白  41
  3.5 亮氨酸饥饿后重补充  41-44
    3.5.1 western blot检测自噬相关蛋白  41-44
    3.5.2 western blot检测mTOR下游蛋白  44
  3.6 干扰mTOR上游调节蛋白  44-52
    3.6.1 干扰Rheb  44-45
    3.6.2 干扰Raptor  45
    3.6.3 干扰Gβ1  45-52
第四章讨论与结论  52-57
  4.1 讨论  52-56
    4.1.1 亮氨酸饥饿对细胞自噬的影响  52
    4.1.2 亮氨酸对细胞自噬的缓解及其信号机制  52-53
    4.1.3 mTOR上游调节蛋白参与亮氨酸对细胞自噬的调节  53-56
  4.2 结论  56-57
参考文献  57-64
致谢  64-65
附录在读期间发表的论文  65

相似论文

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜生理学、生物物理学、生物化学
© 2012 www.xueweilunwen.com