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柯萨奇病毒B3对Hela细胞mTOR/p70S6K表达的调控作用

作　者: 成亮
导　师: 陈淳媛
学　校: 中南大学
专　业: 儿科学
关键词: 柯萨奇病毒B3 Hela细胞 细胞病变效应 mTOR/p70S6K
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：通过检测柯萨奇病毒B3 (Coxsackie virus B3, CVB3)感染“非饥饿法”与“饥饿法”人宫颈癌细胞株(Henrietta Lacks strain of cancer cells, Hela)后不同时间点的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)及细胞内CVB3外壳蛋白、哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,p70S6K) mRNA水平,探讨细胞周期的不同时相对mTOR信号通路的影响及CVB3对Hela细胞mTOR/p70S6K mRNA表达的调控作用。方法：实验分病毒组和对照组。病毒组以CVB3分别感染“非饥饿法”与“饥饿法”’Hela细胞3h、6h、9h、12h、24 h;对照组以病毒维持液培养。通过相差显微镜观察细胞形态学变化,用RT-PCR、Real-Time PCR检测Hela细胞内不同时间点的CVB3外壳蛋白、mTOR、p70S6K mRNA表达,应用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.CVB3感染不同方法培养的HeLa细胞的细胞形态改变：“非饥饿法”和“饥饿法”病毒组感染6h时,即可见细胞病变；随着感染时间的延长,病变效应越明显。2. RT-PCR检测Hela细胞CVB3外壳蛋白mRNA表达：“非饥饿法”与“饥饿法”的病毒组均随感染时间的延长,CVB3外壳蛋白mRNA表达逐渐增加(P<0.05)；各时间点“非饥饿法”与“饥饿法”比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3. RT-PCR和Real-Time PCR检测mTOR、P70S6K mRNA表达：RT-PCR和Real-Time PCR结果均显示,“非饥饿法"mTOR、P70S6K mRNA表达在病毒组感染12 h时明显下调,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；感染3h、6h、9h时间点与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；而“饥饿法”病毒组：mTOR、P70S6K mRNA表达均低于对照组各对应时间点,差异有统计学意义(all P<0.05)；两种方法培养的Hela细胞在感染24h时RT-PCR未检测到mTOR、P70S6K mRNA表达,而Real-Time PCR检测到极低的表达。4.“非饥饿法”与“饥饿法”的Hela细胞mTOR、P70S6K mRNA表达的比较：RPCR和Real-Time PCR结果均显示,病毒组和对照组Hela细胞在各时间点mTOR mRNA表达“饥饿法”均高于“非饥饿法”,差异有统计学意义(all P<0.05)；p70S6K mRNA表达“饥饿法”均高于“非饥饿法”,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.“非饥饿法”和“饥饿法”病毒组mTOR.p70S6K mRNA表达均低于对照组,提示CVB3可诱导Hela细胞mTOR.p70S6K mRNA表达下调。2.CVB3感染12h、24h时,CVB3外壳蛋白mRNA的表达明显增加,而mTOR、P70S6K mRNA表达明显下调,且CVB3感染24 h时,CVB3外壳蛋白mRNA高表达,但无mTOR.p70S6K mRNA表达或表达极低,提示mTOR信号通路可能参与了CVB3诱导的Hela细胞凋亡。3.CVB3感染“非饥饿法"Hela细胞,病毒组仅在12 h.24 h mTOR.p70S6K mRNA表达与对照组比较差异有统计学意义；而“饥饿法”病毒组各时间点与对照组比较均有统计学意义；“饥饿法”病毒组和对照组Hela细胞mTOR.p70S6K mRNA表达均高于“非饥饿法”,提示细胞周期的不同时相对mTOR信号通路有影响,“饥饿法”可减少因细胞周期时相对实验的干扰,优于“非饥饿法”。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
中英文对照缩略词表  10-11
第一章 前言  11-13
第二章 材料和方法  13-19
  2.1 实验材料  13-14
  2.2 实验仪器和设备  14
  2.3 实验方法  14-18
  2.4 数据处理和统计学分析  18-19
第三章 结果  19-37
  3.1 病毒扩增及滴度的测定  19
  3.2 CVB3感染Hela细胞后的细胞形态改变  19-20
  3.3 RNA完整性的鉴定  20-21
  3.4 RT-PCR检测"非饥饿法"Hela细胞各时间点CVB3外壳蛋白、mTOR、p70S6K mRNA表达  21-23
  3.5 RT-PCR检测"饥饿法"Hela细胞各时间点CVB3外壳蛋白、mTOR、p70S6KmRNA表达  23-26
  3.6 RT-PCR检测"非饥饿法"和"饥饿法"Hela细胞各时间点CVB3外壳蛋白、mTOR、p70S6K mRNA表达的比较  26-29
  3.7 Real-Time PCR检测各时间点GAPDH、mTOR、p70S6K mRNA扩增曲线和溶解曲线  29-32
  3.8 Real-Time PCR检测"非饥饿法"Hela细胞各时间点mTOR、p70S6K mRNA表达  32-33
  3.9 Real-Time PCR检测"饥饿法"Hela细胞各时间点mTOR、p70S6K mRNA表达  33-34
  3.10 Real-Time PCR检测"非饥饿法"和"饥饿法"Hela细胞各时间点mTOR、p70S6K mRNA表达的比较  34-37
第四章 讨论  37-42
  4.1 病毒种类和Hela细胞的选择  37-38
  4.2 CVB3感染Hela细胞及感染浓度的选择  38
  4.3 CVB3感染不同方法培养的Hela细胞的探讨  38-39
  4.4 CVB3感染Hela细胞不同时间点的选择  39
  4.5 CVB3对Hela细胞mTOR/p70S6K mRNA表达的调控作用  39-40
  4.6 细胞周期的不同时相对mTOR信号通路的影响  40-41
  4.7 展望  41-42
第五章 结论  42-43
参考文献  43-49
综述1  49-58
  参考文献  54-58
综述2  58-65
  参考文献  62-65
致谢  65-66
在读期间的主要研究成果  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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