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人色氨酰-tRNA合成酶和人脑组织中丰富表达的Ras同源类似物的结构与功能的研究

作　者: 俞亚东
导　师: 丁建平
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 晶体结构 hTrpRS 氨酰化反应血管生成 Rheb 小G 蛋白 TSC 信号传导
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

氨酰-tRNA 合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)是一类古老的蛋白家族,它们在蛋白质翻译的第一步负责将特定的氨基酸连接到对应的tRNA分子上,在此基础上建立了遗传密码子系统。在长期的进化过程中,它们还获得了不同的功能,有的与蛋白质翻译直接相关,而有的则参与到其他的细胞过程中。哺乳动物的aaRS 与原核生物的近亲相比,在它们的N-或C-末端往往具有延长片段。人色氨酰-tRNA 合成酶(hTrpRS)在N-末端有一个约150 个氨基酸组成的额外结构域。选择性剪切和蛋白酶水解产生3个N-末端被截短的形式:mini-、T1-和T2-hTrpRS,它们都具有抑制血管生成的活性。其中最短的形式(T2-hTrpRS)包含了催化结构域并表现出最强的血管生成抑制活性。我们用多波长反常散射的方法解析了2.5? 分辨率的T2-hTrpRS 晶体结构。T2-hTrpRS 和Bacillus stearothermophilus TrpRS (bTrpRS)仅有22%的序列同源性,但是它们的整体结构却惊人地相似。结构比较显示出这两种酶在底物结合口袋和活性中心入口处的一些重要差异,这些差异对于识别与结合底物和tRNA是非常重要的。研究结果提示哺乳动物TrpRS 和细菌TrpRS 可能通过不同的机制来识别底物。另外我们还通过模型构建的方法研究了hTrpRS 与tRNA 的作用方式,实验结果表明tRNA 分子跨接hTrpRS 二聚体的两个亚基,其氨基酸接受臂主要与hTrpRS 的连接肽段1相互作用,而它的反密码子环则结合到hTrpRS的α-螺旋结构域上。结构分析还发现α-螺旋结构域与短链细胞因子相似,提示hTrpRS 的血管生成调节活性位点可能位于这个结构域上。脑组织中丰富表达的Ras 同源类似物(Rheb)是小G 蛋白家族中的一个新成员,Rheb 具有一些独特的生物化学和细胞活性的特征,在结节性硬化综合症相关蛋白TSC1/TSC2 和多功能激酶mTOR 之间传递信号,参与调控细胞的生长。我们通过分子置换的方法解析了人Rheb(hRheb)与GDP、GTP 和GppNHp 的复合物的晶体结构。这些结构揭示了Rheb 不同于已知小G 蛋白结构的崭新的结构

全文目录

第一部分:人色氨酰-tRNA 合成酶催化活性片断的结构与功能的研究  9-63
  引言  9-17
    1. 氨酰-tRNA 合成酶  9-10
    2. 氨酰-tRNA 合成酶及其复合物的结构  10
    3. 第I类c 亚类aaRS  10
    4. 第I类c 亚类aaRS 的晶体结构  10-12
      4.1 细菌的 TyrRS  10-11
      4.2 古细菌和真核生物的TyrRS  11
      4.3 细菌的 TrpRS  11-12
    5. 第 I 类c 亚类aaRS 识别和结合tRNA 的方式  12-14
    6. 高等动物第I 类c 亚类aaRS 进化获得的新功能  14-17
  材料和方法  17-29
    1. 材料和试剂  17-18
      1.1 常用试剂和材料  17
      1.2 菌株  17
      1.3 仪器  17-18
    2. 方法  18-29
      2.1 hTrpRS-Hi56的表达和纯化  18-19
      2.2 溶液中蛋白质分子尺寸和聚集状态分析  19
      2.3 SDS-PAGE  19
      2.4 蛋白质 N-端序列分析  19
      2.5 8834-CodonPlus(DE3)-RIL pET 24a(+)-hTrpRS 表达菌株的构建  19-20
      2.6 硒代甲硫氨酸(Selenomethionine)取代的hTrpRS-Hi56的表达和纯化  20-21
      2.7 蛋白质浓度测定方法  21-22
      2.8 晶体生长-悬滴气相扩散法  22-24
      2.9 X-射线晶体衍射和数据收集  24-25
      2.10 hTrpRS-Hi56的晶体结构测定  25-29
  结果  29-50
    1. T2-hTrpRS 整体结构  29-33
    2. T2-hTrpRS 二聚体结构  33-35
    3. 催化活性中心的结构  35-41
    4. T2-hTrpRS 与bTrpRS 在结构域相对运动上的差别  41-48
    5. hTrpRS 底物口袋开阔的入口  48-50
  讨论  50-57
    1. hTrpRS 识别 ATP 和色氨酸底物的方式  50-51
    2. hTrpRS 识别和结合tRNATrp位点的预测  51-55
    3. 抑制血管生成活性位点的预测  55-57
  结论  57-58
  参考文献  58-63
第二部分:人脑组织中丰富表达的Ras 同源类似物的结构与功能的研究  63-99
  引言  63-69
    1. 小 G 蛋白  63
    2. 脑组织中丰富表达的 Ras 同源类似物(Rheb)  63-64
    3. 对 Rheb 在 MAPK 通路中作用的研究  64-65
    4. 结节性硬化综合症(TSC)相关基因和蛋白  65-66
    5. 雷帕霉素靶点蛋白(target of rapamycin, TOR)  66-67
    6. Rheb 在 TSC 蛋白和mTOR 之间传递信号调控细胞的生长  67-69
  材料和方法  69-77
    1. 材料和试剂  69
      1.1 常用试剂和材料  69
      1.2 仪器  69
    2. 方法  69-77
      2.1 hRheb GTPase 结构域的表达与纯化  69-71
      2.2 hRheb 与鸟苷酸复合物的结晶  71-72
      2.3 X-射线衍射数据收集  72-73
      2.4 结构测定与精修  73-77
  结果  77-89
    1. hRheb 的整体结构  77-82
    2. 磷酸基团结合loop 的结构  82-86
    3. hRheb 有着与 Ras  86
    4. Switch II 独特的构象  86-89
  讨论  89-92
    1. Switch II 独特的构象导致 Rheb 非常低的内在 GTPase 活性  89-90
    2. TSC2GAP 可能通过一种新的调节机制促进Rheb 水解 GTP  90-91
    3. Rheb 代表了 Ras  91-92
  结论  92-93
  参考文献  93-99
发表文章目录  99
获奖  99-100
致谢  100-101

人色氨酰-tRNA合成酶和人脑组织中丰富表达的Ras同源类似物的结构与功能的研究

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