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双启动子shRNA表达载体的构建及其在抑制肿瘤增殖研究中的应用

作　者: 娜仁
导　师: 郭刚；梁东春；杨宇虹；张瑞
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 双启动子 shRNA 表达载体肿瘤细胞 hTERT Bcl-2
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：RNA干扰技术是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默,具有高度特异性,已广泛应用于肿瘤治疗的研究。然而,以往研究报告中的shRNA 表达载体都只能转录生成一种特异性的小干扰RNA,阻断单一基因的表达,很难对肿瘤这种多基因疾病起到治疗效果。我们构建出含有双启动子的shRNA表达载体,并选择在绝大多数肿瘤细胞中都有高表达的hTERT及Bcl-2基因[2,3]进行功能测试,考察这种双启动子shRNA表达载体的基因沉默效果及对肿瘤细胞增殖的影响。而且通过建立这种模式化工具载体,可以为今后RNA干扰技术实验研究的开展和深入奠定基础。方法：1.改造实验室常用的真核表达载体pcDNA3.1(+),切除CMV启动子及其转录终止序列,保留Ampr和Neor基因完整表达框以及原核复制起始点,插入PCR扩增人基因组DNA得到的两段U6启动子,构建出双启动子shRNA表达载体pdPRO。2.针对人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)与B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因序列,根据短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)设计原则,化学合成编码shRNA的DNA单链。将相应的DNA单链退火后分别连在两段U6启动子的下游,构建出靶向hTERT和Bcl-2基因的shRNA重组质粒pdPRO-TB。另外构建对照质粒pdPRO-T(靶向hTERT基因的shRNA重组质粒)及pdPRO-B(靶向Bcl-2基因的shRNA重组质粒),测序鉴定。3.实验分为与实验平行不加细胞的空白对照组、空脂质体组、阴性对照组(pdPRO组)、pdPRO-TB组、pdPRO-T组及pdPRO-B组。将各组质粒同时转染Hela细胞,每组6孔。MTT法检测细胞增殖活性,计算细胞增殖抑制率。结果：1.测序和酶切鉴定证实重组质粒pdPRO、pdPRO-TB、pdPRO-T及pdPRO-B均成功构建。2.各组质粒瞬时转染细胞48h后,与转染前正常生长的Hela细胞相比,pdPRO-TB组悬浮细胞明显增多,贴壁细胞减少,细胞生长减慢；pdPRO-T与pdPRO-B组也出现类似改变,但不如]pdPRO-TB组明显；阴性对照组细胞形态无改变,培养板底部基本被细胞贴满。3.MTT结果显示,时间因素和组别因素对细胞增殖抑制率均有影响(F值分别为287.107,391.590,P<0.01)；时间与组别因素间存在交互作用(F=41.592,P<0.01)。在24h、48h、72h,pdPRO-TB组、pdPRO-T组、pdPRO-B组的细胞增殖抑制率明显高于空脂质体组和阴性对照组(P<0.01),pdPRO-TB组抑制细胞增殖的效果最强,pdPRO-T组次之,pdPRO-B组抑制效果最弱；空脂质体组与阴性对照组之间的细胞增殖抑制率相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。转染24小时后小干扰RNA对Hela细胞增殖的抑制作用开始显现、但效果尚弱,48小时最明显,72小时抑制效果转弱。结论：ShRNA重组质粒pdPRO-TB可以抑制Hela细胞增殖,同时pdPRO-T及pdPRO-B对细胞增殖也有不同程度的抑制作用、但抑制效果次之,这说明靶向hTERT和Bcl-2基因的siRNA对肿瘤细胞增殖的抑制作用可能存在协同效应。同时,这种模式化工具载体的构建及转染实验表明该载体是新型的、高效可行的、并容易操作的工具载体,为多基因调控的肿瘤疾病治疗提供了新的思路,具有重要的科研价值和应用前景。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语/符号说明  10-11
前言  11-14
  研究现状、成果  11-13
  研究目的、方法  13-14
一、双启动子 shRNA 表达载体的构建  14-27
  1.1 对象  14-15
    1.1.1 菌种及载体  14-15
    1.1.2 培养基  15
    1.1.3 分子量参照物及主要生物学试剂  15
    1.1.4 主要化学试剂  15
    1.1.5 引物  15
    1.1.6 试剂盒及抗凝全血标本  15
    1.1.7 仪器、耗材  15
  1.2 方法  15-21
    1.2.1 从抗凝全血中提取人类基因组DNA  15-16
    1.2.2 PCR扩增U6启动子序列  16-17
    1.2.3 质粒pcDNA3.1(+)与U6-B/E双酶切产物的连接  17-20
    1.2.4 质粒psPRO与U6-B/H双酶切产物的连接  20-21
  1.3 结果  21-24
    1.3.1 PCR扩增产物U6-B/E与U6-B/H的电泳结果  21-22
    1.3.2 质粒pcDNA3.1(+)与U6-B/E的双酶切回收产物  22
    1.3.3 重组质粒psPRO的鉴定  22-23
    1.3.4 BglⅡ/HindⅢ双酶切质粒psPRO结果  23
    1.3.5 重组质粒pdPRO的鉴定  23-24
  1.4 讨论  24-26
    1.4.1 RNAi原理及制备siRNA的常用方法  24-25
    1.4.2 双启动子shRNA表达载体的构建思路  25-26
  1.5 小结  26-27
二、双启动子shRNA表达载体的功能测试  27-39
  2.1 对象  27
    2.1.1 细胞株及培养基  27
    2.1.2 主要生物学试剂及化学试剂  27
    2.1.3 ShRNA的正义链及反义链  27
    2.1.4 试剂盒  27
    2.1.5 仪器、耗材  27
  2.2 方法  27-31
    2.2.1 ShRNA重组质粒的构建  27-29
    2.2.2 细胞培养与转染  29-31
    2.2.3 MTT法检测细胞增殖活性  31
    2.2.4 统计学分析  31
  2.3 结果  31-35
    2.3.1 转染前后Hela细胞形态学改变  31-33
    2.3.2 MTT结果  33-35
  2.4 讨论  35-38
    2.4.1 hTERT及Bcl-2在肿瘤治疗中的意义  35
    2.4.2 ShRNA的设计原则  35-36
    2.4.3 各重组质粒转染后siRNA对Hela细胞增殖的影响  36-37
    2.4.4 RNA干扰的问题与展望  37-38
  2.5 小结  38-39
结论  39-40
参考文献  40-44
发表论文和参加科研情况说明  44-45
附录  45-50
综述  50-64
  RNA干扰技术的研究进展  50-60
  综述参考文献  60-64
致谢  64

双启动子shRNA表达载体的构建及其在抑制肿瘤增殖研究中的应用

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