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人胰岛素原基因的设计、分子克隆、构建及其对马铃薯的遗传转化

作　者: 马雪青
导　师: 马建忠
学　校: 兰州理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 马铃薯 patatinⅠ启动子人胰岛素原基因分子克隆农杆菌遗传转化
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 54次
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内容摘要

糖尿病是继心血管疾病、癌症之后致残率、致死率最高的第三大疾病,世界卫生组织已将防治这一疾病列为全球保护人类健康的重要问题之一。胰岛素是治疗糖尿病的最有效的药物。现在使用的胰岛素多是通过细菌或酵母表达系统得到的,相对于大量普通糖尿病人群及其需终身用药而言,其生产成本仍然较高,从而限制了胰岛素的广泛应用。而利用植物生产胰岛素可有效的弥补这一不足。因此,本实验构建了含人胰岛素原基因的植物表达载体,并经农杆菌介导转化马铃薯品种大西洋,为人胰岛素原基因在马铃薯植株中表达奠定了基础。主要研究结果如下1、克隆了马铃薯块茎专一性启动子patatinⅠ启动子基(GU168944),经测序分析,该克隆片段为1100bp,包含有增强子、CAAT box、TATA box和转录起始点序列。与GenBank中公布的已知序列(CQ876983)有96%的同源性。2、根据是否含有信号肽基因,分别设计合成了带有NcoⅠ特定酶切位点的2条引物,亚克隆了patatinⅠ启动子,并与pMD-18T载体连接,得到2个重组子pGPP05(不含信号肽)和pGPP06(含信号肽)。3、根据马铃薯的偏爱密码子和GenBank中人胰岛素原的氨基酸序列,并在人胰岛素原序列的前面加入NcoⅠ酶切位点,后面加上终止密码子和BstEⅡ的酶切位点,设计合成了人胰岛素原基因,并与pMD-18T载体连接,得到重组子pMD-hINS。4、构建了含patatinⅠ启动子与人胰岛素原基因的植物表达载体p1301P05h(不含信号肽)和p1301P06h(含信号肽)。通过冻融法,将构建好的表达载体导入农杆菌菌株LBA4404,经PCR鉴定,获得了转化菌株。5、以大西洋、费乌瑞它、夏波蒂和甘农薯2号4种马铃薯试管苗茎段为材料,进行4个品种茎段的离体再生研究,结果表明大西洋的最适愈伤组织培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA；夏波蒂和甘农薯2号为MS+2.5mg/L6-BA+ 0.2mg/LNAA,Favorita为MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。大西洋和甘农薯2号的最适愈伤组织分化培养基为MS+2.5 mg/L 6-BA+5.0mg/LGA3;夏波蒂为MS+3.5mg/L 6-BA+10mg/L GA3；Favorite为MS+2.5mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 10mg/L GA3。6、农杆菌介导的马铃薯遗传转化的最佳条件是：大西洋茎段外植体,预培养2d,用处于对数生长期OD600=0.5的农杆菌侵染8～10min、共培养2d。不同生长阶段的外植体对潮霉素(Hgy)的敏感性不同,诱导愈伤组织和诱导芽分化阶段以25mg/L的选择压较为适宜,抗性再生芽生根阶段15mg/L为宜。7、通过共培养和抗性筛选获得了能够在含潮霉素的生根培养基上正常生长的马铃薯抗性苗。

人胰岛素原基因的设计、分子克隆、构建及其对马铃薯的遗传转化

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